1. 分子量确认

· 看什么： 将实测分子量与理论分子量进行对比。

· 如何判断：

 · 理论分子量： 根据多肽的氨基酸序列计算得出（包括任何修饰）。

 · 实测分子量： 在质谱报告中找到主峰的质荷比（m/z）。对于电喷雾质谱，通常会看到一系列带不同电荷的峰 [M+nH]ⁿ⁺，软件会据此解卷积计算出完整的分子量。

· 合格标准： 实测分子量与理论分子量的误差应在 10 ppm（百万分之十） 以内。对于小多肽（<5000 Da），误差通常要求更小（<5 ppm）。这是确认身份的第一步。

2. 纯度评估

· 看什么： 液相色谱图。

· 如何判断：

 · 在主峰对应的保留时间处，其峰面积占总峰面积的百分比即为纯度。

 · 研究人员会检查色谱基线是否平稳，主峰是否尖锐、对称。

 · 他们会留意是否有明显的杂质峰，并关注杂质峰的出现时间和面积。

· 合格标准： 对于研究级多肽，纯度通常要求 > 95%，高标准的要求 > 98%。杂质可能包括：

 · 缺失序列： 合成过程中缺失了一个氨基酸的片段。

 · 删除序列： 合成过程中多了一个氨基酸的片段。

 · 氧化/修饰产物： 如甲硫氨酸被氧化。

3. 序列确认

· 看什么： 串联质谱图。

· 如何判断： 这是最有力的证据，直接“读取”氨基酸序列。

 · 质谱仪会选择主峰的离子（母离子），将其打碎，然后测量碎片离子的质量。

 · 多肽在碰撞池中会沿着肽键断裂，产生一系列有规律的 b-离子（从N端开始）和 y-离子（从C端开始）。

 · 通过分析相邻b-离子或y-离子之间的质量差，就可以推断出是哪一个氨基酸。

   · 质量差 87 = Serine

   · 质量差 128 = Glutamic Acid

   · ...以此类推

· 合格标准： 能够通过碎片离子质量差，连续地、无歧义地匹配整个目标序列。这被称为“序列覆盖度”，覆盖度越高，信心越足。