在日常液相色谱分析中，我们常会遇到一类“棘手”的样品——极性很强，在常规C18反相柱上几乎毫无保留，死时间出峰；想换正相色谱，样品在正己烷、异丙醇中又难以溶解。面对这样的困境，亲水作用色谱（HILIC） 往往是那个“救火队员”。

但HILIC这个“救火队员”有点特别——它的固定相看起来像正相色谱，流动相又像反相色谱。这种“左右逢源”的特性，让不少分析人员在方法开发时一头雾水：

同一根硅胶柱，能既用于正相又用于HILIC吗？

为什么在HILIC里，水的洗脱强度和反相完全相反？

流动相、稀释剂、色谱柱保存，到底有哪些“坑”？

1、HILIC到底是什么？

HILIC，江湖人称“含水正相色谱”或“反反相色谱”。

 它的核心特征就一句话：用极性的固定相 + 含高比例有机相的极性流动相，专门用于保留和分离那些在反相色谱上“待不住”的强极性水溶性化合物。

至于保留机制，比反相要复杂一些，普遍认为是“多管齐下”：

分配作用：流动相中的水被吸附到极性固定相表面，形成一层“水膜”，分析物在水膜和流动相之间来回分配。

氢键作用：极性分析物与固定相表面的硅醇基、酰胺基等形成氢键。

静电作用：若固定相或分析物带电荷，还会有离子交换的贡献。

正是这种复杂的多模式机制，赋予了HILIC独特的分离选择性，但也让它比反相“娇贵”得多——对流动相、稀释剂、平衡条件都有特殊要求。

2、HILIC vs 正相色谱：看似一样，实则不同

HILIC和正相色谱都用硅胶（Silica）、氨基（NH₂）、二醇基（Diol）等极性固定相，很多人误以为二者可以“通用”。这是第一个需要纠正的认知误区。

核心结论：固定相的耐水性是区分HILIC柱与普通正相柱的关键指标。用于HILIC的硅胶、氨基柱经过特殊键合或封端处理，以抵抗高含水流动相带来的水解风险。所以——正相柱不一定能用于HILIC，但优质的HILIC柱通常可兼容正相模式。

选柱原则：

样品溶于正己烷、异丙醇？→ 选正相色谱。

样品溶于水？→ 选HILIC色谱。

分析糖类等强极性水溶性样品？→ 推荐耐水性优异的专用柱（如Athena NH₂-RP）。

3、 HILIC vs 反相色谱：水的角色完全相反

这是最容易搞混、也最关键的部分。HILIC和反相色谱虽然都用水和有机溶剂做流动相，但水的“人设”完全不同。

差异1：保留行为相反

反相：极性大的化合物保留很弱，容易死时间出峰。

HILIC：对极性大的水溶性化合物保留显著增强。

这正是HILIC的核心价值所在——专门“收拾”那些在反相上留不住的强极性化合物。

差异2：流动相中水的洗脱强度完全相反

这是HILIC方法开发中最需要转换思维的一点：

在HILIC里，水是“强溶剂”——这个认知不建立，方法开发必然走弯路。

差异3：应用场景互补

核心结论：HILIC与反相在分离能力上完全互补。当反相无法保留目标物时，HILIC就是那个“救火队员”。

4、HILIC使用核心要点

HILIC的“娇贵”体现在它对流动相、稀释剂、平衡和保存都有不容妥协的要求。以下要点整理自大量实践经验，建议重点标记。

1、流动相怎么配？

2、样品稀释剂怎么选？（直接影响峰形）

3、色谱柱怎么平衡？（防止保留时间漂移的关键）

新柱活化：50倍柱体积的50/50乙腈/水相缓冲液（最终缓冲液浓度10 mM）。

进样前平衡：初始流动相平衡至少20倍柱体积。

梯度运行后：初始流动相平衡10倍柱体积。

平衡不充分是保留时间漂移的最常见原因。

4、色谱柱怎么清洗、保存？

清洗再生（柱压升高、峰形变差时）：

常规清洗：50/50乙腈/水，10倍柱体积，去除极性污染物。

强洗再生：若无效，改用5/95乙腈/水（高水相），洗脱强保留的极性杂质。

压力骤升或峰形分叉：首先检查并更换保护柱。

长期保存（这条极易犯错）：

必须保存在95%乙腈中。

绝对禁止在含有缓冲盐的流动相中保存。

操作流程：若流动相含盐，先用10倍柱体积的纯水过渡清洗，再换上95%乙腈保存。此步骤不可省略——否则高浓度乙腈会导致缓冲盐在柱内析出，造成不可逆损伤。

5、 其他实用技巧

梯度起点：方法开发初期，可尝试从95%乙腈梯度至50%乙腈。若样品仍无保留，试等度条件如乙腈/甲醇/水相缓冲液（95：3：2）。

调节选择性：将流动相中的水替换为甲醇、丙酮或异丙醇，可改变选择性，有时能显著增强极性化合物的保留。

洗针溶剂：确保洗针溶液的有机相比例与流动相一致，否则可能引入峰形干扰。

5、总结：一张表看懂三大模式

HILIC不是新生事物，但随着LC-MS的普及和对强极性代谢物、糖基化修饰等生物分子分析需求的增长，它的价值日益凸显。正确理解和使用HILIC，需要把握三个关键认知：

定位明确：HILIC是正相和反相的重要补充，专门服务于极性大、水溶性好的化合物。

角色转换：在HILIC中，水是强溶剂，洗脱规律与反相完全相反——这是方法开发思维上最需转换的一点。

规范操作：HILIC对流动相（禁磷酸盐、保水相下限）、稀释剂（禁用纯水/DMSO）和色谱柱保存（95%乙腈）有严格且不容妥协的要求。