环状细胞穿透肽是啥玩意儿？

细胞穿透肽（CPP）是由5到30个氨基酸组成的短小寡肽，它们就像快递小哥一样，能够把各种货物送到细胞内部，轻松穿过生物膜。环状CPP是这群快递小哥中的佼佼者，经过精心设计，能够高效地穿透细胞膜，确保货物的稳定性和精准送达。与普通的线性CPP相比，环状CPP的N端和C端通过化学手段巧妙连接，形成了一个稳定的环状结构，这样一来，它们在细胞内的吸收能力大大提升，同时也能最大限度地减少被降解的风险.

环状CPP的类型和结构

A. 阳离子环状CPP是个“带电小子”，包括聚赖氨酸和天然鱼精蛋白等成员。阳离子环状CPP的代表有cTAT、FITC-[R3]到FITC-[R9]等一系列“R家族”成员。环状TAT肽是个“电荷大户”，身上带着六个精氨酸和两个赖氨酸残基，这些带正电的残基就像磁铁一样，与带负电的细胞膜建立了牢固的静电联系。而且，研究表明，阳离子环状CPP对细胞外表面的各种阴离子实体，比如膜脂质的磷酸基团、核仁蛋白和硫酸肝素等蛋白聚糖，都有着显著的亲和力，就像磁铁遇到了铁屑，一碰就牢牢粘在一起.

B. 两亲性环状CPP则是个“油水双亲”，在大多数阳离子环肽中，精氨酸和赖氨酸残基喜欢扎堆在一起，但在两亲性肽中，它们却均匀分散在整个序列中，就像一群小朋友在操场上玩，有的喜欢扎堆，有的却喜欢分散开来。此外，两亲性肽还富含疏水残基，比如色氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸等。两亲性环状CPP与质膜的结合及其随后的细胞内摄取方式，与阳离子环状CPP有显著不同。两亲性肽的特点是它们与膜的疏水区有很强的接触，并能被整合到脂质双层中，这种现象在阳离子环状细胞穿透肽中是看不到的，就像两亲性肽是个“油水双亲”，而阳离子环状CPP则是个“电荷小子”，它们与膜的互动方式自然不同，这种差异被认为是主要的相互作用力.

阳离子和两亲性环状 CPP 的结构。（Park S E.等人，2019 年）

环状CPP相对于线性CPP的优势

1. 更高的细胞通透性：环状CPP和线性CPP就像两个快递小哥，环状CPP是个“穿墙高手”，而线性CPP则是个“普通快递员”。实验结果表明，环状CPP变体的细胞通透性始终优于相同序列的线性变体，就像环状CPP能轻松穿过墙壁，而线性CPP却只能绕路走。在存在阿霉素、核苷逆转抑制剂和带负电荷的荧光磷酸肽的情况下，Mandal团队发现富含精氨酸和色氨酸的肽能够穿过细胞，就像这些肽是个“穿墙高手”，而线性CPP则只能望墙兴叹.

2. 更高的抗蛋白水解性：设计细胞穿透肽的一种新方法是通过环化增加CPP的“身体刚度”，就像给快递小哥穿上了一件“防弹衣”。多项研究表明，CPP环化是其抗蛋白水解的原因，就像环化让CPP的“身体”变得更硬，不容易被“敌人”（蛋白水解酶）攻击。研究人员研究了cFΦR4肽类似物的细胞摄取情况，这些类似物是由Qian的团队通过改变立体化学和/或肽序列设计和合成的，就像他们给CPP换了一身“新衣服”。研究人员使用合成氨基酸并改变类似物的序列长度，就像给CPP“量身定做”了一套衣服。结果表明，富含精氨酸残基的环肽[FΦRRRRQ]（其中Φ代表l-2-萘基丙氨酸）具有出色的蛋白水解稳定性，这已通过对小鼠进行的药代动力学研究得到证实，就像这个环肽穿上了“防弹衣”，在小鼠体内也能保持稳定.

3. 提高靶受体亲和力：与线性形式相比，具有环状结构的CPP对靶受体的亲和力要高得多，就像环状CPP是个“黏人精”，而线性CPP则是个“害羞鬼”。亲和力的提高可能是因为环状环更坚硬，可以容忍更恒定的构象，从而使其更善于与静态靶位结合，就像环状CPP的“身体”更硬，更容易与靶受体“拥抱”。Ichimizu团队使用多种棕榈酰-聚-精氨酸CPP创造了一种更有效的进入细胞的药物载体，就像他们给CPP穿上了一件“隐形斗篷”，使其能更好地进入细胞.与测试的线性变体相比，由d-十二精氨酸组成的环状肽棕榈酰-环状-(D-Arg)12被证明是一种非常有效的细胞摄取促进剂，就像这个环状肽是个“超级快递员”，能快速把货物送到细胞内.

4. 表现出有效的内体逃逸：对环状CPP的研究表明，它们具有多种有用的特性，包括增加细胞内吸收、抗蛋白水解和逃避内体降解的能力，就像环状CPP是个“逃脱高手”，能轻松从内体中逃脱。Mandal团队的机制研究表明，即使在没有内体衍生囊泡的情况下，荧光标记的F′-[W5R4K]也能迅速被吸收到细胞核中，就像这个环状CPP是个“隐身侠”，能直接进入细胞核.为了确定环大小对细胞内吸收的影响，Parang团队生产了几种环状[WR]n肽的类似物，就像他们给CPP“量身定做”了不同大小的“环”。那些需要逃离内体才能离开所得内体的环状CPP将极大地受益于这种不依赖内体的细胞吸收，就像这些环状CPP找到了一条“捷径”，能快速从内体中逃脱.上述Qian团队的研究表明，[FΦRRRRQ]直接与细胞膜上的磷脂结合，主要通过内吞作用进入细胞，并有效逃避内体，就像这个环状CPP是个“穿墙高手”，能轻松穿过细胞膜并从内体中逃脱.

与线性 CPP 相比，环状 CPP 具有优势。（Sajid M I.等人，2021 年）

环状CPPs的转运机制

环状CPP可能进行胞吞作用（包括胞饮作用和吞噬作用）、扩散、主动运输、直接渗透/易位和其他细胞进入机制，就像它们有多种“通行证”，可以轻松进入细胞.几种环状CPP通过胞吞作用进行易位，最常见的途径是网格蛋白介导、小窝介导和网格蛋白/小窝独立，就像它们有多种“交通工具”，可以乘坐不同的“车辆”进入细胞.改变实验设置表明可能有多种过程在起作用，就像实验条件的变化让环状CPP的“通行证”和“交通工具”也发生了变化.

对于富含精氨酸和赖氨酸残基的渗透素样CPP，倒置胶束方法被认为是一种直接易位机制，就像这些CPP是个“穿墙高手”，能直接穿过生物膜；此外，它们不需要能量来渗透，也不会与膜上的任何受体结合，就像它们不需要“门票”和“导游”就能进入细胞.含有带正电荷残基的渗透素肽首先通过与细胞膜中带负电荷的磷脂结合形成胶束，就像它们先在细胞膜上“搭了个帐篷”，一段时间后，胶束进入细胞质并释放其货物，其中包括环状CPP，就像“帐篷”拆了，CPP就进入了细胞质.

阳离子抗菌环状CPP的其他相关转运机制包括地毯模型，就像生物膜是个“地毯”，这些CPP像“清洁工”一样附着在地毯上，当这些CPP到达膜时，它们会破坏膜的稳定性，从而导致孔隙形成，为环状CPP和货物打开大门，就像“地毯”被掀开了一角，CPP和货物就趁机进入了细胞.

被动扩散允许具有疏水侧链的微小环状肽进入，其长度小于或等于10个氨基酸，就像这些CPP是个“小偷”，能悄悄地穿过细胞膜；除了具有至少两个疏水残基和三个精氨酸之外，环状肽还应具有不超过九个氨基酸的微小环，就像它们需要满足一定的“身材要求”才能成为“小偷”.

受控两亲性环状CPP通过与生物和内体膜有效结合来提高内体逃逸效率和内吞吸收，就像它们有“通行证”和“交通工具”，能快速从内体中逃脱并进入细胞；这些两亲性环状CPP还可能穿透生物膜并直接进入细胞，但这种穿透的化学机制仍然未知，就像它们有“秘密通道”，但这个通道的秘密还没被揭开.

其他环状CPP可能非特异性地与生物膜表面的蛋白质结合并通过主动运输进入细胞，就像它们有“通行证”和“导游”，能顺利进入细胞.这些过程促进了环状CPP进入细胞.富含精氨酸的肽（RRP）（如TAT肽）还有一条替代途径，可以绕过内吞途径到达核仁和细胞质，就像它们有“后门”，能直接进入细胞的“核心区域”.通过阻断内吞途径，他们对几种细胞系进行了研究，包括BHK21-tTA/anti-CHC和小鼠内皮瘤细胞，就像他们把“正门”堵上了，但发现忽略这些内吞途径并不能阻止TAT肽转导到核仁和细胞质区室，就像TAT肽找到了“后门”，依然能顺利进入细胞的“核心区域”.

环状 CPP 进入细胞所采用的转运方法概述。（Sajid M I.等人，2021 年）

产生环状细胞穿透肽的环化策略

两种常见的环化方法是在N端α-胺基和C端α-羧基官能团之间形成酰胺键，以及桥接两个半胱氨酸侧链，就像给CPP的“头”和“尾”之间搭了一座“桥”，或者让两个半胱氨酸“手拉手”形成环状结构.（参考：纯干货分享之多肽修饰：给多肽“穿新衣”）

当赖氨酸和天冬氨酸产生酰胺时，谷氨酸侧链或主肽会发生环化；然而，该过程仅与环状CPP有关，就像只有环状CPP才能通过这种方式形成环状结构.C端α-羧基和N端α-胺基之间的酰胺键使Pfaff团队于1994年披露了肽的环化，就像他们发现了给CPP“头”和“尾”之间搭“桥”的方法.当肽的N端或C端半胱氨酸侧链被桥接时，就实现了环化，就像半胱氨酸“手拉手”形成了环状结构.合成环状CPP时，二硫键比包括酰胺键在内的更传统的环化方法更受欢迎，就像二硫键是个“万能胶”，能让CPP更容易地形成环状结构.

二硫键环化的可逆性和易用性使其成为改善还原环境中肽构象定义的有用工具，就像二硫键是个“魔法胶”，能让CPP在还原环境中保持稳定的环状结构.根据Lättig-Tünnemann团队的研究，使用二硫键技术进行环化的富含精氨酸的肽和TAT肽在吸收效率方面优于其线性对应物，就像这些环状CPP穿上了“防弹衣”，在细胞内的吸收效率更高.另一项使用相同环化策略但使用二硫键桥接技术并在末端添加半胱氨酸残基的研究表明，Qian团队生成的环状CPP可被HeLa细胞系有效吸收并表现出内体逃逸，就像这个环状CPP是个“超级快递员”，能快速把货物送到细胞内并从内体中逃脱.

环状细胞穿透肽的应用

1. 基因治疗：尽管siRNA介导的基因沉默已作为一种新型癌症治疗选择得到广泛研究，但有效的siRNA细胞内递送挑战尚未克服，就像siRNA是个“害羞鬼”，很难进入细胞内部.许多发现提升了环状CPP在siRNA递送中的潜力，就像环状CPP是个“超级快递员”，能帮助siRNA顺利进入细胞.例如，Shirazi的团队研究了使用涂有环状CPP的金纳米粒子来改善siRNA的运输，就像他们给siRNA穿上了“金甲”，使其更容易进入细胞.研究人员在这项研究中发现，与24小时后单独用siRNA孵育细胞相比，将[WR]5-AuNPs与基于环肽的纳米粒子结合可使HeLa细胞中小干扰RNA分子的递送量增加2至3.8倍，就像环状CPP和金纳米粒子的组合是个“超级快递员”，能大大增加siRNA的递送量.对这些结合物的细胞毒性的研究表明，与其他载体系统（如脂质体）相比，它们非常安全，就像环状CPP和金纳米粒子的组合是个“安全快递员”，不会对细胞造成伤害.

与此类似，Welch等人在体外和体内实验中证明，二硫键约束环肽（Ac-C(FKFE)2CG-NH2和Ac-C(WR)4CG-NH2）可用于将短干扰RNA（siRNA）递送至小鼠肺的胞质溶胶，就像这些环状CPP是个“穿墙高手”，能轻松穿过细胞膜将siRNA送到小鼠肺的胞质溶胶中.这一发现表明，这些环状CPP可用于开发有效的siRNA递送剂，从而破坏与疾病相关的基因的表达，就像环状CPP是个“基因杀手”，能帮助siRNA消灭疾病基因.

2. 药物输送：大分子和其他亲水性药物化合物的运输是一个巨大的障碍，然而环状CPP作为药物转运体显示出巨大的前景，就像环状CPP是个“超级快递员”，能帮助大分子和亲水性药物顺利进入细胞.许多研究表明，它们具有增强现有抗癌和抗菌药物功效的潜力，就像环状CPP是个“药物增强剂”，能让抗癌和抗菌药物更有效.

例如，Parang等人还彻底研究了几种环状CPP作为分子转运体的潜在用途，以[WK]5为例；它已被证明是一种可靠的抗HIV模型药物运输载体，就像[WK]5是个“抗HIV快递员”，能帮助抗HIV药物顺利进入细胞.使用[WH]5可以有效地运送细胞不渗透的有效载荷，就像[WH]5是个“超级快递员”，能快速把货物送到细胞内.[CR]4显示出带负电荷的磷酸肽的细胞吸收率有所提高，而[HR]4已被证明是一种功能性分子转运体，就像[CR]4和[HR]4都是“分子快递员”，能帮助药物顺利进入细胞.

3. 抗菌剂：Oh的团队发现，某些两亲性环肽和类似物对许多药物具有耐药性的微生物具有很强的抗菌作用，就像这些两亲性环肽是“超级抗菌剂”，能消灭耐药微生物.环肽[R4W4]在所有测试的肽中表现出对MRSA的最强抗菌作用，最低抑菌浓度（MIC）为2.67 μg/mL，就像[R4W4]是个“MRSA杀手”，能有效消灭MRSA.在使用不同的疏水性和阳离子氨基酸进行几次环状修饰后，发现四种精氨酸和四种色氨酸氨基酸表现出抗菌作用，就像这些氨基酸是“抗菌明星”，能有效消灭细菌.奇怪的是，环状[WR]4缺乏抗菌特性，但由于其四个交替的精氨酸和色氨酸残基，它能够穿透细胞，就像[WR]4是个“细胞穿透高手”，虽然不能直接消灭细菌，但能帮助其他抗菌药物进入细胞.他们发现了一种荧光标记的-[R4W4]肽，可用于递送不能渗透细胞的抗生素，就像这个荧光标记的-[R4W4]肽是个“抗生素快递员”，能帮助抗生素顺利进入细胞.

为了证明这种抗菌肽具有分子转运能力，科学家将其与四环素结合，发现其杀灭MRSA细菌的效果比单独使用四环素高出4到8倍，就像这种抗菌肽是个“四环素增强剂”，能让四环素更有效地消灭MRSA. 作者推测，当与抗生素联合使用时，环状CPP可能成功抑制MDR细菌，就像环状CPP是个“超级抗菌剂”，能帮助抗生素消灭耐药细菌.

4. 靶向细胞核：受天然化合物FR235222的启发，Hilário团队创建了一种环状四肽，就像他们从天然化合物中得到了灵感，创造出了一个“环状四肽战士”.然后，他们将一种具有生物活性和荧光性的三唑氨基香豆素作为货物模型，并测试了该四肽穿透细胞膜并导致细胞死亡的能力，就像他们给这个“环状四肽战士”装备了一件“生物活性武器”，并测试了它的战斗力.这项研究表明，这种环状CPP可以将微小的生物活性化合物运送到细胞溶胶和细胞核中，就像这个“环状四肽战士”能将“生物活性武器”送到细胞的“核心区域”，发挥出强大的战斗力.

环状 CPP 的生物医学应用摘要。（Park S E.等人，2019 年）

参考文献：

• Park S E., et al., Cyclic cell-penetrating peptides as efficient intracellular drug delivery tools, Molecular pharmaceutics, 2019, 16(9): 3727-3743.
• Sajid M I., et al., Applications of amphipathic and cationic cyclic cell-penetrating peptides: Significant therapeutic delivery tool, Peptides, 2021, 141: 170542.
• Qian Z., et al., Discovery and mechanism of highly efficient cyclic cell-penetrating peptides, Biochemistry, 2016, 55(18): 2601-2612.
• Dougherty P G., et al., Enhancing the cell permeability of stapled peptides with a cyclic cell-penetrating peptide, Journal of medicinal chemistry, 2019, 62(22): 10098-10107.

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