第一作者：公衡

通讯作者：程中一副研究员

通讯单位：江南大学生物工程学院

原文链接：https://doi.org/10.1002/adfm.202514761

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通过支架介导的多酶复合体空间有序组装对于提升催化性能至关重要。然而，构建兼具可编程性与可重复利用性的支架体系仍面临重大挑战。现有方法通常只能实现酶分子的随机分布，而难以实现精确的空间定位，从而限制了级联催化的整体效率。本研究构建了一种完全由蛋白质组成且具遗传可编程性的支架体系，通过将超稳定的自组装γPFD蛋白纤维与由双正交系统SpyTag/SpyCatcher和SnoopTag/SnoopCatcher构成的刚性桥蛋白相结合，实现了宏观、可控的组装结构。该组装体系可形成易于分离与重复使用的宏观材料。通过交替排列携带SpyTag和SnoopTag的γPFD纤维，并调控桥接蛋白的长度，可实现货物蛋白的几何精确共固定化及可调控的空间组织。作为验证性应用，本支架体系显著提高了PETase与MHETase的热半衰期，分别提升约25倍与15倍。在聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）降解反应中，由于优化的酶间距离与潜在的底物通道效应，共固定化酶系的对苯二甲酸产率较游离酶提升约3.2倍。此外，该生物催化剂经10次循环使用后仍保持约75%的初始活性，显示出优异的可重复利用性。该研究提出了一种可编程蛋白质支架的通用设计策略，可在同时提升酶的稳定性、活性与循环使用性能的基础上，促进可持续生物制造领域的发展。

背景介绍

无细胞生物催化体系作为一种可持续且具高选择性的化学合成平台，近年来在高附加值化学品的制造中展现出独特优势，相较于传统化学催化体系具有明显的优越性。在此类体系中，多酶级联反应（multi-enzyme cascade reactions）尤为具有前景，可在单一反应体系中实现复杂化合物的连续合成，从而减少中间产物的分离步骤并提升资源利用率。

然而，尽管无细胞多酶级联系统在高价值产物的合成中发挥着关键作用，其催化效率仍受到多种因素限制，包括中间体扩散速率低、各酶间的反应不相容性、体外反应体系的复杂微环境以及酶本身稳定性差等问题。这些因素共同导致体系整体反应通量下降及产物收率不足。

在自然界中，多酶复合体通常以高度精确的空间方式有序组织，以高效且特异地催化复杂的代谢反应。受此天然多酶催化模式的启发，研究者开发了多种基于 DNA或蛋白质支架的空间组织策略，用以精确定位酶分子并优化生物合成途径。此类仿生固定化策略通过底物通道效应与近距离效应可有效稳定酶结构并提升协同催化效率，其性能受载体的物理化学性质（如疏水性、表面电荷及官能团类型）显著影响。

其中，DNA支架凭借其精确可控的空间构筑能力，在多步酶级联反应的共固定化中表现出极高的有效性，利用先进的DNA工程技术显著提升了酶的活性与稳定性。然而，DNA支架的高合成成本及在保持酶活性前提下实现有效整合的困难，限制了其实际应用。相比之下，蛋白质支架为一种更具成本效益的替代方案，能够通过微生物宿主实现规模化生产并进行遗传水平的可控修饰。这类支架可通过特异性分子识别实现酶的固定化，具有良好的适用性，可用于单酶系统或多酶级联系统的构建，但目前仍存在两方面的主要局限。其一，多数体系仅实现酶在单条蛋白纤维或层状纳米管上的固定化，虽能形成宏观结构，但难以实现如“ -A-B-A-B- ”的精确周期性排列。实际中酶常呈随机分布（如“ -A-A-B-B- ”或“ -A-B-B-A- ”），这主要源于酶与支架结构的空间位阻效应及偶联位点识别缺乏选择性，从而导致酶定位的不确定性。其二，尽管空间有序的多酶体系可增强无细胞催化性能，但多数体系仅适用于一次性使用。若需重复利用，通常需将其固定于多孔琼脂糖微珠、纤维素颗粒或脂质微滴等异质载体上，以便实现分离与回收。尽管已有部分无载体型蛋白支架被提出，但其在实现精确酶图案化与可编程酶间距调控方面仍存在不足。因此，开发具有精确设计偶联位点、可实现多酶精准组织且便于生产与回收的蛋白质支架，对推进生物技术应用至关重要。

研究出发点

1）研究背景与科学问题

在多酶级联反应体系中，酶分子的空间组织方式直接决定了反应效率与中间产物传递速率。传统酶固定化方法虽然能够提高酶的稳定性和重复利用性，但存在以下主要局限：

1.多数体系仅形成可溶性复合物或依赖外部载体，缺乏宏观可操作性；

2.酶的固定方式多为随机吸附，难以实现精确的空间排列与可控的酶间距离；

3.繁琐的纯化与组装步骤限制了体系在实际工业应用中的可行性。

因此，亟需一种能够在无外部载体条件下实现多酶精确排布、空间距离可调且可重复使用的新型纯蛋白材料体系。

2）研究设计思路

为解决上述问题，本研究提出了一种可编程图案化的纯蛋白自组装体系，以实现多酶的有序组装与高效协同催化。我们采用两对正交标签（SpyTag/SpyCatcher 与 SnoopTag/SnoopCatcher）构建模块化支架，形成具有确定性 交替结构的多酶阵列（-A-B-A-B-），并通过 荧光共振能量转移（FRET）实验证实了该有序排布。

3）空间结构可编程性与距离调控

为进一步优化酶间相互作用，我们设计了刚性α-螺旋桥接模块 [A(EAAAK)n A]，并调控 n 值（3、11、25、28）以系统性地调节桥长。该设计实现了从约 8 nm 到 30 nm 的酶间距离可控调节，从而优化了酶的载量、级联反应中底物传递与中间产物转换效率。

4）稳定性与催化性能的提升

固定化后的 PETase 与 MHETase 显示出显著增强的热稳定性：其半衰期分别提升约 25倍与 15倍。在双酶级联反应中，TPA 产率相较于游离酶体系提高约 3.2倍，证明该支架能够有效促进多酶协同反应。

5）简化的组装方式与可重复利用性

该支架体系可直接从粗细胞裂解液中一步自组装，无需传统的多步纯化操作。材料经 10 次循环反应后仍保持约 75% 的初始活性，表现出优异的可回收与耐用性，具备潜在的工业应用前景。

6）机制探索：空间组织与底物通道效应

为揭示支架结构对催化性能提升的分子机制，我们构建了 PETase-SpyC 与 MHETase-SnoopC@γPFD 的复合模型。常规分子动力学模拟（cMD）显示，支架结构在材料界面维持了高局部酶浓度，使两酶活性位点保持紧密邻近。与自由酶体系相比，支架结合态中酶分子呈现更聚集的空间组织（活性位点间距离约为 24.2 Å，而自由态为 46.7 Å）。该空间聚集效应可能促进了底物通道化（substrate channeling），从而降低扩散阻力并提升反应通量。元动力学模拟（Meta-MD）显示，固定化体系中MHET成功由PETase转移至MHETase活性位点，能量面上出现两个明显的局部极小值，分别对应MHET结合到PETase与MHETase上的状态。而在自由体系中，MHET直接扩散到溶液中，未与MHET结合。

7）总体创新与科学意义

本研究以“空间可编程化的纯蛋白自组装体系”为核心创新点，系统解决了传统多酶催化体系中存在的空间不可控、载体依赖、稳定性不足等关键瓶颈。该体系在宏观尺度（可回收操作）、分子尺度（精确空间排布）及功能层面（协同催化增强）均实现了创新突破，为设计新型高效、多功能的生物催化材料提供了新的理论与技术基础。

图文解析

图 1. 可编程蛋白支架的设计与构建

本研究首先构建了一种基于γ-prefoldin (γPFD) 的可编程蛋白支架（图1）。γPFD 具有天然自组装形成纳米纤维的能力，研究者在其两端分别引入 SpyTag 与 SnoopTag 功能模块，以实现正交化修饰。随后，利用含刚性α-螺旋片段 (EAAAK)_n 的 SpyC-(EAAAK)n-SnoopC 桥蛋白作为分子连接元件，实现了不同长度（约 8、15、25、30 nm）的精确交联，从而赋予支架可控的几何结构特征。SDS-PAGE 验证了各功能蛋白的高纯度表达与可溶性，并分析了不同桥长的桥接蛋白的实际分子量。整体设计实现了从分子模块到宏观结构的可程序化构建，为后续多酶精确排列提供了结构基础。

图 2. 桥蛋白长度调控与交联组装行为

图2展示了桥蛋白长度可编程性及其在 γPFD 纤维间的交联效果。通过调节 (EAAAK)_n 的重复次数（n=3、11、20、28），不同长度桥蛋白（8、15nm、25nm、30nm）在TEM中表现出可预测的线性增长关系。将 γPFD-SpyT、γPFD-SnoopT 与不同长度桥蛋白SpyC-(EAAAK)n-SnoopC混合后，体系随反应时间由澄清变为浑浊，并在约 4 h 后出现絮状沉淀，表明异肽键驱动的交联逐步进行。SDS-PAGE 显示高分子量复合物条带的出现进一步证明了交联反应的成功。桥蛋白的理性设计为控制材料微观形貌和酶空间组织提供了可调手段。

图 3. 组装比例优化与交联机制验证

在图3中，作者系统研究了 γPFD 与桥蛋白的装配比例对凝胶形成与交联效率的影响。结果显示，当 γPFD : bridge protein比例为 1:1:1 时体系迅速形成致密凝胶，而 16:16:1 时难以形成宏观结构；相比之下，4:4:1 体系兼顾了结构稳定性与孔隙可用性，成为最优组装条件。DLS 动态光散射监测到粒径随时间及bridge protein浓度而逐步增大，表明交联过程具有可控的动力学特征；在将γPFD-spyT及γPFD-snoopT上的关键作用位点D156及K158突变为丙氨酸后，粒径不再增大，表明异肽键驱动蛋白模块组装为宏观材料。FT-IR 光谱在 1680 cm^-1 处出现新的特征峰，证明体系形成了 SpyTag-SpyCatcher/SnoopTag-SnoopCatcher 异肽键。该结果明确了最佳装配条件，并从化学层面验证了支架的共价交联机制。

图 4. 材料形貌与环境稳定性分析

图4对不同组装比例下材料的微观形貌及环境稳定性进行了系统评估。TEM 与 SEM 显示，1:1:1 比例形成的交联网络结构致密且孔隙较少，而 4:4:1 体系的交联网络结构较为松散且孔隙率较大。热稳定性与化学稳定性测试结果表明，材料在 20~100 ℃、c(NaCl) = 0~300 mM 及 pH 5-9 条件下均能保持形貌完整，γPFD 的高熔点特性赋予材料优异的耐热性与环境适应性。该部分结果证明该全蛋白支架在复杂条件下仍具高度稳定性，为其在工业催化环境中的应用提供了结构与性能保障。同时，该蛋白支架可由表达γPFD-spyT、γPFD-snoopT及桥蛋白的细胞破碎液混合制备，杂蛋白可通过更换缓冲液的方式去除而非复杂的纯化流程，这提供了一种低成本合成方案。

图 5. 荧光共振能量转移（FRET）实验证实可控分子间距

为验证桥蛋白长度对空间布局的调控作用，作者利用荧光共振能量转移（FRET）技术进行实验验证。将客体蛋白 mCerulean3 与 mVenus 通过(GGGGS)2分别与SnoopCatcher、SpyCatcher结构域融合表达得到mCerulean3-snoopC和mVenus-spyC，之后将两者与宏观材料逐步孵育分别定位至 γPFD-snoopT 与 γPFD-spyT，并通过不同长度桥蛋白交联后测定能量转移效率。结果显示，FRET 强度随桥长从 8 nm 增至 30 nm 逐渐下降，符合能量转移随距离平方反比的理论规律。共聚焦显微成像（CLSM & Z-stack）结果显示客体蛋白共定位效果良好。该实验在分子尺度上直接证明了桥蛋白长度能够精确调节蛋白分子间距，为后续实现多酶的几何化排列、中间产物的穿梭提供了实验证据。

图 6. 固定化酶热稳定性与催化性能提升

图6评估了支架在单酶固定化及双酶级联体系中的性能表现。SDS-PAGE 结果证实 PETase 与 MHETase 均成功共价结合至支架，且不同桥长条件下酶负载量有所差异，桥长越长，载量越高；同时，支架对客体蛋白B的载量受客体蛋白A的影响，桥长越短，影响越大。酶学测试结果表明，固定化后酶的比活性与游离状态相当，但热稳定性显著提高：PETase 的热半衰期提升约 25倍，MHETase 提升约 15倍。该结果说明该支架在保持催化性能的同时显著增强了酶的抗热变性能力，体现出优异的稳定化效果与应用潜力。

进一步的催化性能测试（图6g）显示，以 BHET 为底物时，15 nm 桥长体系在 20 min 内生成 2.74 mM TPA，较游离双酶体系（1.39 mM）提升约 1.97 倍，并优于 25 nm 与 30 nm 桥长体系。8 nm 桥长因空间位阻过大而被排除。结果表明，15 nm 桥长在酶间距与传质效率之间实现最佳平衡，显著促进了 PETase 与 MHETase 间的底物通道化与协同催化。

反应动力学分析（图6h）进一步证实，15 nm 桥长体系可在 45 min 内实现 BHET 到 TPA 的完全转化，而游离双酶体系需约 90 min。该结果表明，固定化体系显著提高了反应速率与转化效率。综上，图6验证了该可编程支架在提升酶稳定性与催化性能方面的显著优势，其中 15 nm 桥长构型在结构稳健性、反应活性与可重复利用性之间实现了最优平衡

图 7. 双酶协同催化的结构机制、通道化效应、可回收性能及高效PET降解性能

图7综合展示了固定化 PETase/MHETase 双酶体系的结构模型、分子动力学分析、实验验证及PET降解性能，揭示了可编程蛋白支架在实现多酶空间协同与增强催化效率方面的分子机制。

在结构层面（图7a），作者构建了 PETase-spyC 与 MHETase-snoopC 共价固定于 γPFD-spyT/γPFD-snoopT 支架的复合模型，其中两类 γPFD 纤维通过 15 nm 桥蛋白交联形成三维有序网络。与游离酶体系中酶分子随机扩散不同，固定化系统中的两种酶被精确定位于相邻位点，沿 γPFD 螺旋表面呈规则交替排列。200 ns 常规分子动力学（cMD）模拟表明，固定化体系中 PETase 与 MHETase 活性位点（Ser134 与 Ser182）间的平均距离为 24.2 Å，远小于游离体系的 46.7 Å。这一结果说明，支架的空间约束作用有效促进了酶间的聚集与构象稳定性，从而可能提升中间体传递效率。

为进一步揭示中间体传递过程，作者利用相同构型进行了 20 ns 元动力学模拟（Meta-MD）（图7b ~ c）。结果显示，在固定化体系中，中间体 MHET 可在 PETase 释放后迅速进入 MHETase 活性位点，能量面上出现两个稳定能谷，对应 MHET 分别结合于两种酶的状态。而在游离体系中，由于酶间距离扩大至约 83.4 Å，中间体迅速扩散至溶液中而未被捕获。固定化体系中酶间距始终维持约 18.7 Å，验证了可编程支架通过限定空间与定向排布显著促进了中间体的高效传递与底物通道化效应。

在功能验证上（图7d ~ f），循环使用实验显示，固定化体系经 10 次催化后仍保留约 75% 的初始活性，表明材料具有优异的可重复使用性与结构稳定性。进一步在 PET 实体底物降解实验中，固定化双酶体系展现出显著增强的分解效率。以结晶度 26.4% 的 PET 粉末为底物，反应 10 天后生成 TPA 浓度达 12.56 mM，为游离酶体系（3.93 mM）的 3.2 倍（图7e）。SEM 成像显示固定化体系作用后的 PET 表面更为粗糙，说明降解更为彻底（图7f）。增强的降解效率主要归因于两方面：其一，PETase 与 MHETase 的空间邻近性促进了级联反应与中间体快速传递；其二，支架的不溶性增强了其对 PET 固体表面的吸附能力。荧光蛋白吸附实验进一步验证了这一点，固定化材料对 PET 的吸附率高达 94.14%，为游离酶体系（21.94%）的约 4.3倍，表明支架不仅能在溶液中维持酶活，还能与疏水性塑料表面形成更强结合，从而促进降解反应。

总体而言，图7系统揭示了该可编程蛋白支架通过空间几何约束与多向交联结构，有效缩短酶间距离、增强中间体传递与底物吸附，从而在分子、动力学与宏观反应层面实现了显著的催化增效与可回收性提升。这一设计策略为多酶协同催化体系的空间精准构筑和塑料生物降解领域的绿色高效转化提供了可推广的新范式。

总结与展望

本研究创新性地设计并构建了一种完全由蛋白质组成、可编程且可回收的宏观支架材料。研究团队以γ-prefoldin (γPFD) 为基础，通过在其两端引入 SpyTag/SnoopTag 体系，实现了蛋白纳米纤维的定向自组装；进一步利用含刚性螺旋片段 (EAAAK)n 的 SpyC-(EAAAK)n-SnoopC 桥蛋白，实现了长度可调的精确交联，从而赋予材料在纳米至亚微米尺度上的几何可编程特性。该体系表现出优异的结构稳定性，在高温、高盐及宽 pH 条件下仍能保持形貌完整，并显著提升了固定化酶的催化性能与循环使用能力。在 PETase/MHETase 双酶级联体系中，固定化后两种酶的热稳定性分别提升约 25 倍和 15 倍，TPA 产物生成速率提高约 3 倍，且经十次循环仍保持约 75% 的催化活性。研究实现了从结构设计到功能输出的可控耦合，为构建可持续、多功能的生物催化平台提供了新思路。展望未来，随着可编程蛋白模块、分子胶体系及计算设计工具的持续发展，该策略有望进一步拓展至更复杂的多酶级联反应，实现高阶通道化酶网络的构建，以模拟细胞代谢复合体的精准分工；同时，通过引入动态可控支架（如光响应或 pH 响应型桥蛋白），有望实现催化开关与智能调节；此外，该类绿色可循环蛋白材料在塑料降解、生物能源转化及医用材料等领域也具有广阔的应用前景。

课题组介绍

江南大学生物工程学院周哲敏教授团队主要致力于酶催化转化与工业生物技术的研究。课题组聚焦在以腈水合酶（NHase）及其他工业酶为核心，结合蛋白质工程、底物通道结构重塑、基因编辑／底盘菌设计，以及“结构-序列-通道”一体化主动设计流程，构建高活性、高选择性、高稳定性的生物催化体系。研究涵盖从机制解析（如底物通道与门控残基、协同进化位点）到工程改造（如热稳定性优化、底物谱扩展、全细胞催化剂构建）再到应用转化（如手性化学品、生物基合成路径）等环节，形成“理解→设计→应用”的完整链条，具备鲜明的交叉学科和产业导向特点。

原文信息

Heng Gong, Yiwei Meng, Yuzhou Sun, Boning Yang, Lekang Wang, Xiaoyi Lin, Laichuang Han, Junling Guo, Xiaonan Zhu, Lukasz Peplowski, Zhemin Zhou, Zhongyi Cheng. Design of a Programmable and Recyclable Protein Scaffolding Material with Geometrically Precise Enzyme Patterning for Improved Cascade Catalysis. Adv. Funct. Mater. 2025, e14761. doi: 10.1002/adfm.202514761