摘要

由细菌生物膜定植介导的植入物相关感染仍是骨科假体失效的主要原因。传统的高剂量抗生素治疗方案临床疗效有限，常需清创后更换假体，此类干预措施给患者带来巨大的心理和经济负担。为应对这一挑战，本研究通过整合氧化亚铜纳米颗粒（Cu₂O NPs）与铜离子载体伊利斯莫（ES），构建了具有双酶活性的ES@Cu₂O纳米酶，旨在通过增强类铜死亡效应对抗植入物相关感染。ES@Cu₂O纳米酶利用其类过氧化物酶（POD-like）活性催化内源性过氧化氢（H₂O₂）转化为活性氧（ROS），在生物膜微环境中产生强烈的氧化应激。同时，其类谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px-like）活性有效消耗过表达的谷胱甘肽（GSH），从而增强ROS介导的治疗效果。值得注意的是，ES加剧了细胞内异常的Cu²⁺积累，强化了类铜死亡效应。与Cu₂O治疗组相比，ES@Cu₂O治疗组在体外表现出显著更强的抗菌和生物膜清除能力。RNA测序（RNA-seq）分析显示，在ES@Cu₂O治疗组中，包括三羧酸（TCA）循环、丙酮酸代谢和氧化磷酸化在内的关键能量代谢通路相较于Cu₂O治疗组受到显著抑制，这支持了ES介导的Cu²⁺超载可有效增强类铜死亡的作用机制。在体内实验中，ES@Cu₂O在小鼠植入物相关感染模型中展现出优异的抗菌和组织修复效果，同时生物安全性评估证实其全身毒性可忽略不计。总之，本研究揭示了具有双酶活性的ES@Cu₂O纳米酶通过增强类铜死亡，能有效清除植入物相关感染中的生物膜并根除定植细菌，为临床转化提供了一种潜力显著的新型治疗策略。

背景简介

人工材料植入物在现代骨科治疗中不可或缺。然而，这些植入物器械的惰性表面为细菌粘附与定植提供了有利条件，进而促使细菌生物膜的形成，造成了严峻的术后挑战。细菌生物膜具有致密的物理结构和富含多糖、蛋白质及胞外DNA（eDNA）的细胞外基质，营造了一个抗生素耐药、呈酸性（pH 5.5）且富含过氧化氢（H₂O₂）和还原型谷胱甘肽（GSH）的微环境。这些生物膜充当物理屏障，将细菌与宿主免疫系统隔离，阻止巨噬细胞及其他免疫细胞吞噬和清除其中包埋的病原体。此外，与其浮游状态相比，被生物膜包裹的细菌表现出显著降低的抗生素敏感性。因此，一旦生物膜在植入物表面形成，细菌便会产生极强的耐药性。传统的抗生素疗法通常只能杀灭部分浮游细菌，而对生物膜内包裹的细菌影响甚微。临床上，此类病例往往需要进行二次植入物取出手术并彻底清创，给患者带来巨大的身体、心理和社会经济负担。为解决这一临床困境，迫切需要开发针对植入物相关感染的非手术性有效治疗策略。

研究概况

近年来，纳米酶技术的快速发展使其在生物医学及众多其他领域得到广泛应用。这些合成酶不仅具备制备简便、性能稳定、成本低廉等纳米材料优势，还能模拟天然酶的催化活性中心，表现出类酶活性。其中，铜基纳米酶在抗菌治疗领域备受关注。其类过氧化物酶（POD-like）活性可利用生物膜微环境中的内源性H₂O₂产生大量活性氧（ROS），破坏已形成的生物膜并杀灭定植细菌，同时规避细菌耐药性。此外，其类谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px-like）活性可耗竭过表达的 GSH，增强 ROS 介导的抗菌和抗生物膜效应。这些特性促使学界对铜基纳米酶的抗菌机制展开深入研究。既往研究表明，细菌胞质中过量的铜离子（Cu²⁺）会与三羧酸（TCA）循环中的硫辛酰化蛋白结合，诱导 DLAT 寡聚化并导致铁硫簇蛋白丢失；同时，异常的Cu²⁺积累还会损害氧化呼吸链中的电子传递，引发细菌毒性。这种由铜超载诱导的细胞死亡被定义为“类铜死亡（cuproptosis-like death）”。由于细胞内 Cu²⁺的异常积累，类铜死亡能够产生强大的杀菌效果，且不受细菌细胞壁或抗生素耐药性的阻碍。因此，研究推测：提高胞质Cu²⁺浓度可加剧细菌的类铜死亡，从而显著增强铜基纳米酶的杀菌效力。然而，细菌的细胞质膜通过协同调控铜的输入、输出、感应和缓冲系统来维持细胞内铜稳态。这种强大的防御机制使得仅通过增加胞外Cu²⁺浓度的干预措施，不足以破坏稳态并实现细胞毒性的铜超载。因此，迫切需要能够直接破坏细胞内铜稳态以诱导铜超载的新策略。为攻克这一难题，伊利斯莫（elesclomol, ES）被确定为一种有潜力的候选分子。ES 是一种Cu²⁺离子载体，可促进跨膜Cu²⁺转运。其机制在于：劫持膜转运蛋白，绕过内源性Cu²⁺输入蛋白（CTR1），同时抑制外排泵（ATP7A）。这种独特机制形成了 "特洛伊木马"效应，能有效使胞质被Cu²⁺淹没，破坏细胞内铜稳态。理论上，ES 能够提高经铜基纳米酶处理的细菌胞质内Cu²⁺浓度，诱导Cu²⁺超载，从而增强类铜死亡。

该研究中，作者团队通过将氧化亚铜纳米颗粒（Cu₂O NPs）与伊利斯莫（ES）封装于聚乙二醇（PEG）基质中，成功构建了具有双酶活性的 ES@Cu₂O纳米酶。该材料通过增强类铜死亡，有效对抗植入物相关感染（如机制图1所示）。在酸性生物膜微环境中，ES@Cu₂O可控降解，释放铜离子与ES。游离的Cu²⁺通过其类过氧化物酶（POD-like）活性催化内源性H₂O₂转化为具有细胞毒性的•OH，同时其类谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px-like）活性消耗了生物膜微环境中过表达的GSH，从而放大氧化应激。协同作用下，ES加剧了细胞内异常的Cu²⁺积累，放大了类铜死亡效应。体外实验表明，与Cu₂O处理组相比，ES@Cu₂O处理组展现出显著更强的抗菌与生物膜清除能力。转录组测序（RNA-seq）分析揭示，在ES@Cu₂O处理组中，包括三羧酸（TCA）循环、丙酮酸代谢和氧化磷酸化在内的关键能量代谢通路相较于Cu₂O处理组受到显著抑制，这为“ES介导的铜超载可有效增强类铜死亡”的机制提供了有力支持。在体内实验中，ES@Cu₂O在小鼠植入物相关感染模型中表现出优异的抗菌与组织修复效果，同时生物安全性评估证实其全身毒性可忽略不计。该研究表明，具有双酶活性的ES@Cu₂O纳米酶可通过增强类铜死亡，有效清除植入物相关感染中的生物膜及定植细菌，为临床转化提供了一种潜力显著的新型治疗策略。

机制图1：ES@Cu₂O的合成与其治疗植入物相关感染的机制。

图1. ES@Cu₂O的合成与表征。该研究通过聚乙二醇（PEG）包覆将Cu₂O NPs与ES结合，成功制备ES@Cu₂O纳米酶。TEM、XRD、FTIR、XPS等表征证实材料结构稳定、均匀（图1A–F）。pH响应释放实验显示，在模拟生物膜酸性环境（pH 5.5）中，Cu²⁺和ES释放率显著高于中性条件（图1G–H），实现了感染微环境的靶向释放。

图2. ES@Cu₂O的双重类酶活性。ES@Cu₂O在酸性条件下表现出显著的POD-like活性，能催化H₂O₂生成活性氧（ROS）（图2B–G）。同时，其GSH-Px-like活性可有效消耗生物膜中过表达的还原型谷胱甘肽（GSH），增强氧化应激效应（图2H–I）。与单纯Cu₂O NPs相比，负载ES后未影响其本身的类酶活性（图2J）。

图3. 不同处理组对MRSA与E. coli的抗菌效果比较。ES@Cu₂O对MRSA和E. coli均表现出显著的杀菌效果，加入低浓度H₂O₂后杀菌能力进一步增强。

图5. ES@Cu₂O对MRSA生物膜的清除效果。在生物膜模型中，ES@Cu₂O + H₂O₂组可几乎完全清除MRSA生物膜，在结晶紫染色、CLSM 3D成像与生物膜SEM中均表现出显著的细菌生物膜清除作用。

图6. 细菌转录组学机制分析。RNA-seq分析发现，ES@Cu₂O处理组中与能量代谢相关的TCA循环、丙酮酸代谢、氧化磷酸化等通路基因显著下调。进一步RT-qPCR验证了关键基因（如PK、acs、ppaC等）表达抑制。

图7. ES@Cu₂O作用机制示意图。

图8. 小鼠体内生物膜感染模型。在小鼠植入物感染模型中，ES@Cu₂O治疗组无红肿、溃烂表现，植入物表面细菌脓样组织显著减少，周围组织炎症轻微，愈合情况显著优于对照组。

图9. 植入物及周围组织超声匀浆涂布平板及周围组织吉姆萨染色切片结果均展现了治疗组显著的疗效。H&E和Masson染色结果同样提示治疗组处理后显著的炎症缓解与组织修复能力。

总结与讨论

综上所述，该研究成功开发出一种具有POD-like和GSH-Px-lik活性的pH响应型纳米酶ES@Cu₂O，用于治疗植入物相关感染。该纳米酶通过其POD-like活性催化内源性H₂O₂转化为ROS，在生物膜微环境中产生强烈的氧化应激压力；同时其GSH-Px-like活性有效消耗过表达的GSH，从而增强ROS介导的治疗效果。与Cu₂O相比，ES@Cu₂O在体外表现出显著更强的抗菌及生物膜清除能力。RNA测序分析表明，相较于Cu₂O，ES@Cu₂O能显著抑制三羧酸循环、丙酮酸代谢和氧化磷酸化等关键能量代谢通路，提示ES介导的Cu²⁺超载可有效增强类铜死亡（cuproptosis-like death）效应。在体内实验中，ES@Cu₂O在小鼠植入物相关感染模型中展现出优异的抗菌与组织修复效果，且生物安全评估证实其全身毒性可忽略不计。总体而言，ES@Cu₂O代表了一种极具潜力的生物医用材料策略，用于治疗植入物相关感染。后续研究将聚焦于规模化生产、长期生物安全评估以及面向临床转化的临床前功效验证。