第一作者：卢海峰 官佩鑫

通讯作者：刘震

通讯单位：南京大学

论文DOI：10.1021/acsnano.4c07416

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该论文着重归纳总结了南京大学刘震团队在分子印迹溶酶体降解剂的制备及其在免疫检查点阻断疗法中的应用，并揭示了该降解剂调控免疫抑制效应的作用机制，有望促进临床抗肿瘤免疫治疗药物的发展。

图1.MILND逆转PD-L1介导肿瘤免疫抑制效应的示意图

背景介绍

癌症免疫治疗，特别是免疫检查点阻断疗法，在几种类型的肿瘤中已取得重要的临床进展。程序性死亡配体1(PD-L1)，癌细胞上过表达的I型跨膜蛋白，已被发现是一种免疫抑制性配体。PD-L1与其特异性受体程序性死亡受体-1(PD-1)相结合，传递共抑制信号通路，从而抑制T细胞的活化，保护肿瘤细胞免受T细胞介导的免疫监视和肿瘤杀伤，这是肿瘤细胞免疫逃避的关键机制。因此，有效阻断PD-1/PD-L1轴是抗肿瘤免疫治疗一种有前景的策略。

纳米分子印迹聚合物是一种化学合成的仿生识别材料，也称为人工抗体。纳米分子印迹聚合物在形状、大小和功能基团上与模板分子高度互补，使得其具备对目标分子高亲和力和特异性的识别性能。此外，由于它的纳米粒子性质，纳米分子印迹聚合物可通过胞吞方式内化和以“内体-溶酶体”途径转运至细胞溶酶体中。然而，利用 其双重属性，以纳米分子印迹聚合物作为降解剂用于诱导受体蛋白靶向溶酶体降解，目前尚未见文献报道。

鉴于此，课题组利用硼亲和锚定分子印迹技术，设计与制备一种肿瘤细胞靶向的分子印迹溶酶体纳米降解剂(MILND)。不同于传统治疗性抗体通过结合靶蛋白多肽结构域来阻断其信号通路，本研究中制备的MILND通过识别N-端表位特异性绑定肿瘤细胞表面PD-L1，促进肿瘤细胞摄取。该过程靶向诱导PD-L1转运至溶酶体降解，从而下调肿瘤细胞表面PD-L1的表达水平。作为结果，MILND可逆转PD-L1介导的肿瘤免疫抑制效应，并引发持久的抗肿瘤免疫应答(图1)。

研究出发点

作者利用硼亲和锚定分子印迹技术，以PD-L1 N-端表位为靶标，制备了MILND。以吸光度值为指标，我们考察了在最佳印迹条件下制备的MILND对目标肽段的亲和识别性能。此外，TEM图像和DLS结果显示制备的MILND呈均一分散的球形，粒径约∼43 nm。概括起来，上述结果表明我们成功合成了MILND (图2)。

图2. MILND的合成与表征

之后，作者在细胞层面上考察了MILND的肿瘤靶向性能、细胞摄取及其亚细胞定位。共聚焦和流式结果显示制备的MILND能特异性识别过表达PD-L1的肿瘤细胞，促进细胞摄取并最终定位于溶酶体，为阐明调控PD-L1介导免疫抑制效应的作用机制提供了部分实验依据(图3)。

图3.体外肿瘤靶向、细胞摄取和溶酶体定位

下调肿瘤细胞表面PD-L1的表达水平能有效阻断PD-1/PD-L1轴，从而激活T细胞介导的免疫应答。因此，作者通过免疫荧光成像和蛋白印迹技术考察MILND对肿瘤细胞PD-L1水平的影响。结果发现，相比于阴性对照组，肿瘤细胞表面PD-L1的水平至~ 33.9% (图4)。

图4. MILND诱导PD-L1的溶酶体降解。

接下来，我们考察了MILND的活体生物分布。在体的近红外荧光成像显示，MILND在静脉注射到荷瘤小鼠体内后，主要分布在肝脏和肿瘤组织，并有较长的滞留时间。离体组织成像验证了这一结论。上述结果表明，MILND对PD-L1 N-端表位的靶向识别促进了其在小鼠肿瘤部位的蓄积程度以及延长在体内的滞留时间(图5)。

图5. MILND的体内生物分布。

最后，作者利用荷瘤小鼠模型验证MILND的体内抗肿瘤治疗的可行性。研究结果表明，在15天的治疗期间，MILND处理的小鼠存在明显的肿瘤生长抑制，其肿瘤抑制率为~74 % (图6)。活体机制探究进一步表明MILNDs显著促进DCs成熟和肿瘤部位浸润的T细胞活化(CD8+和CD4+ T细胞)以及调控免疫细胞因子的表达，最终有效激活机体的抗肿瘤免疫应答(图7)。

图6.体内抗肿瘤治疗

图7. MILND激活T细胞介导的抗肿瘤免疫应答

总结与展望

研究团队利用硼亲和锚定分子印迹技术，设计与制备了一种名为MILND的纳米免疫治疗剂。MILND通过结合肿瘤细胞表面PD-L1 N-端表位，促进细胞摄取并诱导PD-L1转运到溶酶体降解, 从而下调PD-L1的表达水平，最终逆转PD-L1介导的肿瘤免疫抑制效应。当前的工作为MILND激活T细胞介导的免疫应答，触发持久的抗肿瘤功效提供了强有力的证据。此外，由于本实验中的印迹方案具有普适性，我们的治疗策略可以很容易地扩展到其他免疫检查点。综上所述，本研究不仅为抗肿瘤免疫治疗提供了一种有前景的策略，而且为分子印迹抗肿瘤纳米药物的开发提供新的设计思路。

参考文献

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课题组介绍

刘震，南京大学特聘教授，博士生导师，国家杰出青年基金获得者，英国皇家化学会会士。1998年于中国科学院大连化学物理研究所获博士学位。2000-2002年，日本兵库大学日本学术振兴会（JSPS）特别研究员；2002-2005年，加拿大滑铁卢大学博士后。2005年获聘南京大学教授，2006年起任博士生导师，2008年入选教育部“新世纪优秀人才”， 2011年-2014年任加拿大滑铁卢大学工程学院兼职教授，2014年获国家杰出青年科学基金，2016年入选江苏省“333高层次人才”（第二层次）。英国皇家化学会会士、中国化学会高级会员、美国化学会会员，兼任国际分子印迹学会理事会理事、中国质谱学会常务理事、中国化学会色谱专业委员会副主任委员、中国化学会质谱专业委员会委员、中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业委员会委员、《Analytica Methods》副主编、《Electrophoresis》、《Separation Science Plus》、《Journal of Chromatography Open》、《分析化学》和《色谱》等杂志编委。主要从事分子识别、亲和分离、疾病诊断、单细胞分析和癌症纳米治疗等研究，主持国家重大科研仪器项目和基金委重点项目等国家级科研项目10余项，已在Chemical Society Review，Accounts of Chemical Research，Angewandte Chemie International Edition，Nature Protocols，Adcanced Science, ACS Nano和Chemical Science等期刊上发表论文200余篇，目前h因子58，主编及合著著作2部，出版专章7章，获授权专利18项。2011年和2017年先后获中国分析测试协会科学技术奖一等奖共2次，2016年获Phenomenex & Analytical Scientist联合颁发的科学人文奖银奖。2020年荣获美国化学会测量科学进展讲座奖。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.accounts.3c00059