第一作者：乔茜茜

通讯作者：李草、匡映

通讯单位：湖北工业大学

论文DOI：https://doi.org/10.1002/adfm.202414837

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通过简单的氧化还原反应构建了一种新型Ce-Mn异质结CeO₂Mn_1.08O_x纳米团簇，并以此为基础构建了酶级联系统(Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG。异质结结构增强了CeO₂Mn_1.08O_x的类POD与OXD酶活、赋予了CeO₂Mn_1.08O_x微酸性条件下更强的类CAT活性、同时赋予了CeO₂Mn_1.08O_x近红外光热能力。酶级联系统的高效运行结合低温光热治疗使(Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG可高效低毒的消融肿瘤。

背景介绍

纳米酶是一类具有生物催化功能的纳米材料，能够基于特定的纳米结构催化天然酶的底物并作为酶的代替品，这一概念由中国科学家阎锡蕴院士首先提出。国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）将纳米酶技术列为2022年化学领域十大新兴技术之一。基于酶/纳米酶的催化治疗是一种新兴的癌症治疗方法。然而，酶/纳米酶的催化能力受限于复杂的肿瘤微环境（TME），难以达到预期的治疗效果。因此，开发在TME中依旧具有高催化活性的新型纳米酶十分必要。

改变催化活性、特别是活性位点，可通过不同化学物质的适当组合来实现。氧化铈（CeO₂）纳米粒子是一种常用于纳米医疗的纳米酶。它有高比表面积、高储氧容量、Ce(III)和Ce(IV)的混合价态等特性。这些特性有助于CeO₂在各种环境下都能够保持相对较高的催化性能。与天然酶不同，CeO₂纳米酶可以在较宽的pH和温度范围内体现出Ce(III) 依赖的类过氧化物酶（POD）活性。此外，CeO₂也可以作为过氧化氢酶（CAT）拟物，在生理或微酸性环境中从Ce(IV) 可逆转化为Ce(III)，分解肿瘤内源性H₂O₂以生成O₂。

研究出发点

如Figure 1所示，为了进一步提升CeO₂纳米酶在TME中的催化活性、赋予其新的特性，本文作者以H₂SO₄/KMnO₄氧化商业化CeO₂纳米粒子前驱体，制备了一种新型Ce-Mn异质结CeO₂Mn_1.08O_x纳米团簇。其中，Mn以α-MnO₂晶型存在。作为一种同样常用于纳米医疗的纳米酶，MnO₂纳米粒子可将TME中过表达的、对基于活性氧（ROS）的催化治疗不利的还原性谷胱甘肽（GSH）转化为氧化型谷胱甘肽（GSSG）、并可在酸性环境下促进肿瘤内源性H₂O₂的分解为O₂。同时，两种反应的产物Mn²⁺也可以作为POD拟物，促使高细胞毒性的羟基自由基（•OH）生成。与其他晶形的MnO₂相比，α-MnO₂催化活性最高。α-MnO₂和CeO₂在配位和晶格参数上的较大差异可能导致非均质界面上的晶体缺陷，进而产生氧空位（OVs），可作为催化活性位点。此外，MnO₂是一种窄带半导体，可以提高对光的利用。在与宽带隙的CeO₂纳米粒子构成异质结后，特殊的结构在显著提升MnO₂与CeO₂各种催化活性的基础上赋予了CeO₂Mn_1.08O_x两种纳米粒子原本不具备的近红外（NIR）光热能力。同时作者发现，与绝大部分纳米酶不同，CeO₂Mn_1.08O_x在微酸性条件下拥有更强的类CAT酶活，这个非常有趣的特性使得CeO₂Mn_1.08O_x更适合在癌细胞内发挥疗效。

Figure1. Schematic illustration of the
preparation process of (Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG and its mechanism for enhanced
combination therapy in cancer cells.

随后，作者构建了一个由CeO₂Mn_1.08O_x、葡萄糖氧化酶（GOx）、聚乙烯亚胺（PEI）和聚乙二醇（PEG）组成的纳米酶级联系统(Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG。相较CeO₂，CeO₂Mn_1.08O_x表现出高比例的Ce(IV)/Ce(III)和Mn(IV)，使其成为催化肿瘤内源性H₂O₂生成O₂的理想催化剂，从而缓解乏氧、增敏GOx的饥饿治疗。而GOx在O₂参与下可分解葡萄糖产生H₂O₂。这样，酶级联反应可形成循环，各种治疗手段均可被增敏。不仅如此，CeO₂Mn_1.08O_x的类POD活性使(Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG可在酸性条件下将H₂O₂分解成剧毒的•OH。相较CeO₂，CeO₂Mn_1.08O_x异质结构的界面增强了还原性和储氧能力，可以与周围的水或氧和晶格氧发生反应，产生高细胞毒性的ROS如•OH和•O₂^-。这表明CeO₂Mn_1.08O_x同时具备类OXD活性。CeO₂Mn_1.08O_x还可以消耗内源性GSH，增敏基于ROS的催化治疗。此外，CeO₂Mn_1.08O_x的NIR光热能力使 (Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG可用于光热治疗（PTT）。

Figure2. Photothermal heating curves of (Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG
aqueous dispersions at different concentrations (calculated as the
concentration of CeO₂Mn_1.08O_x)
under the irradiation of an 808 nm laser at a power density of 1.25 W·cm^-2(a) and (Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG dispersions (CeO₂Mn_1.08O_xconcentration of 100 μg·mL^-1) under the irradiation of an 808
nm laser at different power densities (b). Heating and cooling curve of a (Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG dispersion for five laser on-off
cycles under the irradiation of an 808 nm laser (1.25 W·cm^-2) (c).
Calculation of the photothermal conversion efficiency of (Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG at
808 nm (d and e). (T₀ = 20 °C) Activity of CMO and DFT
calculations. PDOS profiles of CeO₂ (f), MnO₂ (g), and
CeO₂Mn_1.08O_x (h) structures. E_f= Fermi level. Green shading marks the increased DOS.

如Figure 2所示，作者首先测算了CeO₂Mn_1.08O_x和(Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG在808 nm波长下的光热转化效率，分别为约28.9%和约23.1%。相比之下，商业化的CeO₂及MnO₂纳米粒子在NIR区域并未展现出明显的光热能力。。作者通过密度泛函理论（DFT）计算给出了Ce-Mn异质结获得NIR光热能力的原因。如Figure 2所示，投影态密度（Patial density of states, PDOS）分析表明，与CeO₂与MnO₂模型相比，CeO₂Mn_1.08O_x结构在导带和价带边缘的PDOS显著增加。这表明电子可以很容易地被光激发到导带，证明CeO₂Mn_1.08O_x结构存在等离子体共振效应（Surface Plasmon Resonance, SPR）。因此，可以认为，对于CeO₂Mn_1.08O_x，当超过临界浓度时在NIR区域可以观察到表面SPR现象。

Figure3. Changes in O₂ concentration of
the CeO₂Mn_1.08O_x (a) and (Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG
(e) aqueous dispersions (CeO₂Mn_1.08O_xconcentration of 25 μg·mL^-1) in the presence of H₂O₂at different concentrations at 37 °C and pH 7.4. Michaelis-Menten kinetic
analysis (b and f) and Lineweaver-Burk plotting (c and g) of CAT-like activity
of CeO₂Mn_1.08O_x and (Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG with H₂O₂as a substrate (n = 3). Changes in O₂ concentration of the CeO₂Mn_1.08O_xaqueous dispersions in the presence of 0.625 mM H₂O₂ at
different temperatures and pH values (d), Changes in O₂concentration of the (Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG aqueous dispersions in the presence of
0.625 mM H₂O₂ at different temperatures and pH values
with or without glucose (6 mM) (h). Charge difference distribution of optimized
adsorption and the calculated Bader charge of H₂O₂molecules on CeO₂, MnO₂, CeO₂Mn_1.08O_x, and CeO₂Mn_1.08O_xwith H⁺ (i).
Free-energy diagrams of CeO₂, MnO₂, and CeO₂Mn_1.08O_xmodels in the CAT-like
catalysis process without(j) or with H⁺(k).

如Figure 3所示，CeO₂Mn_1.08O_x与(Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG均体现出了极强的类CAT活性（远强于商业化CeO₂和MnO₂）。对于 (Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG，在加入葡萄糖的情况下依然可以有效提升测试液中溶解氧的浓度。鉴于GOx对葡萄糖的分解需要消耗大量O₂，因此可以证明酶级联反应的成功运转。特别有意思的是，与绝大部分CAT拟物不同，CeO₂Mn_1.08O_x与(Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG在微酸性环境下（pH 5.5）比pH 7.4时有更显著的类CAT活性。为阐明其强的特异性类CAT活性的原因，作者同样进行了DFT计算。计算结果表明，相比CeO₂和MnO₂，CeO₂Mn_1.08O_x更易吸附H₂O₂，而H⁺会进一步提升CeO₂Mn_1.08O_x与H₂O₂的结合能力；同时H₂O₂更倾向于向CeO₂Mn_1.08O_x而不是CeO₂提供电子，更易失去一个氢原子并可被活化形成O₂。在H⁺存在的情况下，计算得出MnO₂、CeO₂和CeO₂Mn_1.08O_x对H₂O₂的吸附和活化自由能变化（ΔG）分别为-3.20、-3.00和-2.18 eV。这表明在吸附和解离H₂O₂的过程中，H⁺在介导催化结合力方面起着关键作用。

Figure4. Time-dependent absorbance changes at 652
nm as a result of the oxidation of TMB in Tris-HCl buffer (pH 5.5) with the
addition of different concentrations of (Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG at 20 °C (a).
Michaelis-Menten kinetic analysis (b) and Lineweaver-Burk plot (c) of the
OXD-like activity of (Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG with H₂O and O₂as substrates (n = 3). EPR spectra showing •O₂⁻ generation of CeO₂Mn_1.08O_xin a normoxia or hypoxia (d). Charge difference distribution of optimized
adsorption of O₂ molecules on CeO₂, MnO_2, and
CeO₂Mn_1.08O_x (e). Normalized absorbance at 652
nm of different concentrations of CeO₂Mn_1.08O_xaqueous dispersions in the presence of H₂O at 20 °C and pH 5.5 (n =
3) (f). EPR spectra showing OVs formation of CeO₂ and CeO₂Mn_1.08O_xin normoxia (g). The proposed mechanism of CeO₂Mn_1.08O_xfor OXD-like activity (h). Free-energy diagrams of CeO₂, MnO_2,and CeO₂Mn_1.08O_x models in the OXD-like
catalysis process (i).

如Figure 4所示，作者系统考察CeO₂Mn_1.08O_x和(Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG的类OXD活性，同时，也提出了可能的反应路径。O₂首先被吸附到活性中心并形成中间体*O₂。DFT计算表明CeO₂Mn_1.08O_x对O₂∙nH₂O分子吸附和活化的ΔG为-0.65 eV。相比之下CeO₂和MnO₂对O₂的吸附能力较弱，ΔG分别为-0.74和-1.23 eV。最后，当生成的*O₂∙nH₂O中间体从纳米酶的表面分离时，会产生*OH。计算表明这个过程是决速步。而此过程CeO₂Mn_1.08O_x的ΔG远小于CeO₂和MnO₂。结合电子顺磁共振结果可以认为，*OH最终很可能会转化为•OH。同时，对于O₂∙nH₂O的吸附和解离过程，OV活性位点的存在起着重要的作用。DFT提供的能量变化阐明了CeO₂Mn_1.08O_x类OXD活性的可能原因和催化路径。

Figure 5. Photothermal images of 4T1
tumor-bearing BALB/c mice after intravenous injection with (Ce-Mn)-PEI-PEG and (Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG and irradiation with an 808
nm laser (1.25 W·cm^-2) (a) and
the temperature rise curves of the tumors (b) (n = 3). Duration of intravenous
injection and irradiation by an 808 nm laser (1.25 W·cm^-2) for 10 min in tumor-bearing mice (c). Weight change curves (d) and tumor growth curves (e) of mice after different treatments. Photograph (f) and weight (g) of tumors after excision from each
group. (n = 6).

最后，作者考察了(Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG对荷瘤小鼠的治疗效果。如Figure 5所示，(Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG及含(Ce-Mn)-PEI-PEG的对照组材料经尾静脉注射后，均可在小鼠肿瘤处体现出光热能力。注射(Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG并进行激光照射后，小鼠的肿瘤出现明显的消融。治疗14天后平均肿瘤重量仅为注射PBS的对照组小鼠肿瘤平均重量的约8.3%。肿瘤处相对较低的升温（约9.2 °C）可降低对正常细胞的伤害，也可减轻小鼠在治疗过程中的痛苦。另外，各种实验结果也表明(Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG对小鼠无明显伤害，具备一定的生物安全性。

总结与展望

综上所述，本文设计构建了一种新型的多功能Ce-Mn异质结CeO₂Mn_1.08O_x团簇，并以此为基础构建了一种多酶活的酶级联系统(Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG。特殊的异质结结构赋予了CeO₂Mn_1.08O_x强的类POD和OXD活性、特别是有别于传统纳米酶的在微酸性环境下更强的类CAT酶活，也赋予了CeO₂Mn_1.08O_x NIR区光热能力。在合理控制用药剂量的情况下，(Ce-Mn)-PEI/GOx-PEG可于小鼠体内实现增强的催化/低温光热联合治疗，在保证生物安全性的前提下有效消融肿瘤。该工作获得了国家自然科学基金（51973053、51773055及22073025）的支持。

通讯作者介绍

李草：湖北工业大学生命科学与健康工程学院教授、博士生导师。中国生物材料学会高级会员、湖北工业大学高层次人才。本科毕业于武汉大学应用化学专业、博士毕业于武汉大学高分子化学与物理专业，导师为张先正教授。曾任湖北大学首届沙湖学者、湖北大学学术道德与仲裁专门委员会委员、健康科学与工程学院学位评定分委员会委员。2024年3月入职湖北工业大学生命科学与健康工程学院，现为学院院长助理、教学指导委员会委员。主要研究方向为用于重大疾病诊疗的纳米药物。至今主持国家自然科学基金3项、省部级项目3项、其他项目若干，累计纵向经费500余万。参与发表高水平SCI论文100余篇，他引3800余次，H因子35（基于Web of science数据）。其中第一及通讯作者论文近50篇，累计影响因子300多。第一发明人身份申请国家发明专利10余项，授权9项。

匡映：湖北工业大学生命科学与健康工程学院副教授、南湖学者、教学指导委员会委员。本科毕业于武汉大学药学专业，博士毕业于武汉大学高分子化学与物理专业，师从卓仁禧院士。曾获得湖北工业大学“雁临奖学金”优秀青年教师，湖北工业大学“百优教师”等荣誉称号。主要研究方向为纳米递送系统的微结构设计与大分子软物质结构与功能研究，主持国家自然科学基金、省部级科研项目等10余项，发表高水平研究论文60余篇，其中SCI收录53篇（1区37篇，2区10篇），EI收录2篇，他引1000余次，申请国家发明专利8项，授权5项。