第一作者：刁志钿、彭祺群

通讯作者：马波研究员、杨世辉教授、徐健研究员

通讯单位：中国科学院青岛生物能源与过程研究所、湖北大学

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-63929-7

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如何在庞大的微生物群体中，高效、精准地筛选出代谢产量高、环境耐受性强的优异菌株，是制约菌种选育与产业化应用的关键环节。近日，青岛能源所单细胞中心联合湖北大学和青岛星赛生物科技有限公司，研发出一套AI驱动的数字化克隆挑选仪（Digital Colony Picker, DCP），实现了单细胞高通量多表型筛选。该平台突破传统微生物筛选技术瓶颈，以16,000个皮升级可寻址微腔室的微流控芯片为核心，结合AI图像分析与激光诱导气泡（LIB）技术，实现了无琼脂、无物理接触的微生物单细胞分辨率高通量筛选。在运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）的应用中，成功筛选出乳酸产量提升19.7%、30g/L乳酸胁迫下生长速率提高77.0%的突变菌株，并发现外膜自转运蛋白基因 ZMOp39x027 是调控乳酸耐受性的关键基因。DCP平台兼具时空精度与高通量优势，为微生物细胞工厂的菌株改造与功能基因挖掘提供了通用技术方案。

背景介绍

如何在庞大的微生物群体中，高效、精准地筛选出代谢产量高、环境耐受性强的优异菌株，是制约菌种选育与产业化应用的关键环节。微生物细胞工厂在可持续燃料、材料和医药等领域具有重要支撑作用。然而，在“设计-构建-测试-学习”（DBTL）这一合成生物学核心循环中，细胞表型筛选一直是效率最低的“限速”环节。传统平板培养依赖宏观指标，通量有限，难以捕捉到“万分之一”概率的稀有优质突变体；液滴微流控虽可实现高通量筛选，但流程复杂、易交叉污染，且难以动态追踪细胞状态。因此，亟需一种既具高通量，又可精准捕捉多维表型的新一代筛选平台。此外，作为工业重要底盘菌的运动发酵单胞菌，虽因高效糖代谢、高乙醇产量及抗逆性强等特点被广泛关注，但其高产、高耐受菌株的快速筛选一直缺乏有效技术手段，制约了其在生物炼制中的应用。

研究出发点

本研究的核心出发点在于解决三大关键问题：

1）单细胞分辨率与高通量的矛盾：突破传统方法“群体评估”局限，实现单细胞水平的动态表型监测，同时保证筛选通量以满足工业菌株库筛选需求；

2）筛选流程的稳定性与兼容性：避免液滴微流控的液滴融合、污染风险，设计封闭且可动态调控的培养环境，支持长期培养与培养基更换；

3）功能基因挖掘与表型的直接关联：通过高效筛选获得具有目标表型（如高乳酸产量、高胁迫耐受）的菌株，进一步解析其遗传机制，为菌株定向改造提供靶点。

基于此，研究团队提出整合“微流控芯片 + AI图像分析 + 激光诱导气泡分选”的技术方案，开发DCP平台，旨在为微生物表型筛选提供“单细胞分辨率 - 高通量 - 高稳定性 - 功能可追溯”的一体化解决方案，助力筛选出“更高”、“更快”、“更强”的工业优质菌株。

图文解析

DCP平台的整体设计，包含微流控芯片、光学监测、激光分选三大核心模块。微流控芯片为三层结构（PDMS模具层 + ITO金属膜层 + 玻璃层），内置16,000个皮升级微腔室（图1A-B）。工作流程分为三步：真空辅助单细胞加载与培养（1分钟内完成细胞加载，微室单细胞占有率30%）、AI辅助单克隆识别（通过 Faster R-CNN 定位微腔室、SegNet 识别菌落区域）、激光诱导气泡（LIB）分选（1064 nm 激光触发微气泡，推动液滴至主通道，分选效率800个微室/分钟），最终将目标液滴收集至96孔板（图1C-D）。

图1. DCP系统结构与工作流程

为了验证芯片能否为单细胞培养提供稳定环境，研究人员以GFP标记的大肠杆菌为模式生物，从加载效率、蒸发控制、培养基更换三个关键维度提供数据支撑。芯片结构中的气相分割保证每个微腔室都是一个独立的培养单元（图2A）。通过统计不同细胞浓度下的微腔室占用情况，明确1 × 10⁶ CFU/mL为最优浓度，此时~30%微腔室含单个细胞，~5%微腔室含多个细胞，既满足单克隆培养需求，又避免细胞浪费（图2B）。通过24小时液体损失率监测（仅6%），证实芯片边缘水通道设计可有效抑制蒸发，尤其在6小时对数生长期内无明显损失，保障细胞生长不受环境波动影响（图2C）；为了验证“动态调控能力”，通过荧光素钠与罗丹明B的培养基更换实验，显示5分钟内可完成微腔室内液体更换，且细胞无流失、无交叉污染，证明芯片支持长期培养中的环境调整，为后续动态表型监测奠定基础（图2D-F）。

图2. 微流控芯片培养性能验证

通过AI算法验证与物理分选实验，验证DCP平台的识别精度与分选可靠性。AI识别逻辑如图3A所示，“定位 - 分割 - 提取”的三步法，为后续数据解读提供框架。细胞浓度与AI识别数量的线性拟合（R²=0.998）证实AI可精准量化微室中细胞数量，无明显计数偏差（图3B）。明场（细胞生长）与荧光场（代谢表型）图像（图3C），证明AI可同步捕获两种表型信息，为多维度筛选提供技术可能。针对“高通量成像”痛点，提出“点到面”全芯片成像策略——通过20×16个视野的拼接，20分钟内完成16,000个微室的全覆盖成像（图3D）。以荧光素钠液滴为模拟样本，LIB分选回收率达97%，证明物理分选无明显损失；进一步以大肠杆菌单克隆为样本，分选后固体培养基上的菌落形成率达96%，证实激光触发的微气泡不会损伤细胞活性，保障分选后细胞可正常培养，为后续菌株验证提供前提（图3E-F）。

图3. AI图像识别与分选效率验证

针对“单细胞分辨率”与“稀有表型捕获”，研究人员通过动态监测与混合体系筛选实验，探究DCP技术与传统方法的差异。监测微腔室中大肠杆菌单克隆的生长过程（0-6小时），从单个细胞到肉眼可见菌落的变化如图4A所示。基于图4A的图像数据，通过AI提取70个单细胞的生长曲线，捕捉到细胞异质性——部分微室存在延迟期差异（图4B），而传统群体培养无法发现此类细微差异，证实DCP在单细胞动态分析上的独特价值。结合荧光标记的代谢生物传感器，DCP可以借助AI对微腔室内细胞的代谢表型进行监测，实现“生长 - 代谢”双表型的同步追踪（图4C）。针对工业筛选中“稀有菌株难捕获”的痛点，构建GFP阳性/阴性大肠杆菌混合体系（比例1:10至1:1000），图4D显示在1:1000的极低比例下，目标细胞占比仍可达到80%，证明DCP可发现稀有优良菌株，解决传统筛选中“漏筛”的问题。

图4. 单细胞表型动态监测与稀有菌株筛选

以运动发酵单胞菌（工业重要底盘菌）为研究对象，构建含乳酸生物传感器的菌株库（将代谢表型转化为荧光信号），再通过芯片培养、荧光监测锁定高荧光信号微腔室，最终分选目标菌株（图5A）。明场图像可检测由单个细胞形成的显微单克隆，结合荧光图像可直接筛选出生长迅速且乳酸产量高的显微单克隆，LIB技术使目标显微单克隆能够以液滴形式被导出并收集（图5B）。经过基于DCP平台的一轮筛选后，获得五株菌株。进一步发酵验证，分选的菌株相比于原始菌株乳酸产量均有提高，其中。 S-3菌株乳酸产量较对照提升17.3%，证明DCP进行菌株筛选的有效性（图5C）。

图5. 运动发酵单胞菌中乳酸高产菌株筛选

筛选出来的S-3菌株利用DCP平台进行新一轮的乳酸耐受筛选。在30g/L乳酸胁迫条件下，筛选出4株耐受菌。通过发酵验证，S-3-4菌株在30g/L乳酸胁迫下，生长速率较对照提升77.0%，葡萄糖消耗完全，乳酸净产量提升19.7%，证明其兼顾高产与耐受特性（图6）。通过全基因组测序，定位到ZMOp39x027基因突变，为表型差异找到遗传基础。研究人员过表达该基因的野生型菌株在30g/L乳酸胁迫下生长速率显著提升，证实该基因编码的外膜自转运蛋白可增强乳酸耐受性，明确其功能机制。

图6. 高乳酸耐受菌株筛选与功能基因解析

总结与展望

本研究开发的DCP平台，首次实现“单细胞分辨率多模态表型监测 - 高通量筛选 - 无接触分选 - 功能基因追溯”的技术闭环。该平台可在单细胞水平并行筛选多维度表型，大幅加快优良菌株发现进程，为代谢工程、环境微生物资源挖掘及工业菌株优化提供了关键技术支撑。未来，DCP技术有望广泛应用于酶功能验证、适应性实验室进化、微生物资源挖掘等领域，进一步助推绿色生物制造与合成生物学的快速发展。值得关注的是，DCP平台与前期开发的拉曼流式细胞分选仪 FlowRACS，形成了功能互补的“协同搭档”：FlowRACS擅长“瞬时快照 / 分选”，以每分钟数百个细菌单细胞的通量，通过拉曼光谱“指纹”信号实现即时、非破坏性的代谢表型筛选与目标细胞分选，助力筛选更高产菌株；DCP平台则侧重“动态追踪 / 回收”，依托微腔室培养可在时间维度上追踪细胞的生长过程、代谢变化及形态演化，助力筛选生长更快、耐受更强的菌株。二者结合构建起系统化解决方案，可快速筛选出“更高”、“更快”、“更强”的工业优质菌株。

课题组介绍

马波研究员、徐健研究员课题组主页：http://www.single-cell.cn/

杨世辉教授课题组主页：http://sky.hubu.edu.cn/info/2123/16965.htm

原文信息

Zhidian Diao#, Qiqun Peng#, Sijun Luo, Lingyan Kan, Anle Ge, Wei Gao, Runxia Li, Weiwei Bao, Xixian Wang, Yuetong Ji, Jian Xu*, Shihui Yang*, Bo Ma*. AI-powered high-throughput digital colony picker platform for sorting microbial strains by multi-modal phenotypes. Nature Communications, 2025, 16: 8769.