第一作者：王文博， Chanan D. Sessler

通讯作者：刘嘉

通讯单位：哈佛大学，麻省理工学院， 博德研究所

论文DOI：10.1021/acs.accounts.4c00049

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本文展示了在活体系统中原位合成与组装功能材料和器件的最新进展。这一方法突破了传统的化学、光学或基因技术的局限，通过在目标细胞、组织或动物体内直接组装功能材料，实现了对生物系统的记录、操作和增强。该论文总结了几种策略，包括无靶向方法和基于内源标记物的靶向组装，尤其是通过基因工程实现的酶催化中心在特定细胞类型中的组装。

图1：活体系统中功能材料和器件的原位合成和组装的代表性策略示意图

背景介绍

整合功能材料和设备与活体系统的能力开启了通过传统化学、光学或遗传方法无法实现的新途径。这些新方法能够在空间和时间上精确控制功能材料的合成和组装，从而实现对生物系统的记录、操控或增强。传统上，这些先进的材料和设备通常通过化学或物理反应在生物系统外部（ex situ）合成，然后再与生物系统整合。这种外部合成方法虽然成熟，但在与细胞精确结合、穿透细胞膜和血脑屏障（BBB）等方面存在显著挑战。这些障碍限制了材料与设备在微观和纳米尺度上的精确控制和及时整合，这是调控细胞功能的关键要求。

相对于外部合成方法，原位组装（in situ assembly）提供了一种潜在的解决方案。原位组装方法是直接在生物系统内的目标位置，将小分子或构建块组装成功能材料。这样可以实现对材料合成和组装的时空和遗传控制，使其更适合生物系统的精细调控和功能增强。近年来，原位组装方法在活体细胞、组织和动物中的应用取得了显著进展，展示了其在基础生物学研究、疾病治疗和生物医学工程中的广泛潜力。

研究出发点

本文重点讨论了从传统的非靶向方法到基于生物系统内源性标志物的靶向功能材料和设备组装策略，并重点介绍了基于遗传靶向的功能材料组装，该方法利用在生物系统中表达的酶促催化中心在特定分子定义的细胞类型中组装功能材料。文章还介绍了我们课题组与麻省理工学院/博德研究所王潇课题组合作利用原位合成的电功能聚合物在遗传靶向的方式下调控膜电容和神经元兴奋性的最新成果 （图1）。

主要结果

图2：(a) 层层组装概念在胰岛上的应用。 (b) 荧光标记的多层膜在胰岛上的自组装。(c-d) 金属-有机框架 (MOFs）在酵母细胞表面的仿生结晶作为细胞保护外壳（c）以及细胞活力比较（d）。 (e) 活细胞内的光引发自由基聚合。 (f) 铁酚甲基丙烯酸酯（FMMA）的共聚合在透射电子显微镜（TEM）下形成可见纳米颗粒。 (g) 细胞表面引发的PET-RAFT。

（1）非靶向方法（图2）

非靶向方法利用物理吸附、化学接枝等方式在细胞或组织表面组装功能材料。尽管这种方法具有灵活性，但在细胞毒性等方面也面临挑战。研究者通过多种创新策略克服了这些问题，使得这些技术在生物相容性和功能性方面得到了显著提升。

·层层组装（Layer-by-Layer, LbL）技术：这种方法通过物理吸附或化学接枝的方式，在细胞或组织表面逐层组装聚合物薄膜。早期研究表明，通过在细胞外基质上交替浸泡阳离子和阴离子聚电解质溶液，可以控制细胞的粘附和增殖特性。尽管这种方法可以灵活地部署多种聚合物化学和功能，但其在细胞上的初始应用受到聚阳离子的细胞毒性限制。为了克服这一问题，研究者在聚赖氨酸（PLL）侧链上嫁接了聚乙二醇（PEG）链，降低了电荷密度，减少了膜孔形成，提高了细胞的存活率和功能。

·金属有机框架（MOFs）：MOFs是一种由金属离子和有机配体组成的多孔材料，已广泛用于药物递送和生物催化。MOFs在活体细胞表面组装的研究展示了其作为细胞保护层的潜力。例如，研究者在酿酒酵母表面组装了ZIF-8框架，这种MOF壳层能够在允许营养物质通过的同时，保护细胞免受裂解酶和抗真菌剂的侵害。

·光引发自由基聚合：通过利用小分子单体在活细胞内部进行光引发的自由基聚合，可以生成功能性纳米粒子。比如，在活细胞内进行N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）的光引发自由基聚合，形成的纳米粒子在细胞核内形成，而预制的HPMA纳米粒子无法进入细胞核。这种方法显示了原位聚合在生物相容性和功能性材料合成中的优势。

图3：基于内源标志物或酶的原位组装. (a) 内源性碱性磷酸酶（ALP）触发的寡肽纳米纤维组装。 (b) 磷酸四肽（pTP-Me）纳米纤维与NF-κB抑制剂的协同作用。 (c) 含紫杉醇的寡肽前体。 (d) 形成纳米纤维后对轴突分支的影响。 (e) 纳米纤维的电镜表征。 (f) 斑马鱼脑内导电聚合物凝胶的体内聚合。 (g) 用于聚合脑电测量的系统示意图。 (h) 带有金电极的斑马鱼脑切片。(i) 脑切片在金电极上的I-V曲线。

（2）基于内源性标志物或酶的靶向组装（图3）

这一部分介绍了利用内源性酶在特定细胞类型中组装功能材料的方法。通过酶催化反应，能够实现高度特异性的功能材料组装，展示了其在生物系统中的广泛应用潜力。

·内源酶触发的组装：利用内源性酶催化在特定细胞类型中组装功能材料是一种新兴的方法。碱性磷酸酶（ALP）是一种常见的内源酶，能够催化寡肽纳米纤维的形成。例如，研究者设计了一种磷酸化的D-三肽前体，在HeLa细胞中被ALP去磷酸化后，生成的肽纳米纤维可以诱导细胞凋亡。此外，结合NF-κB抑制剂的酶促自组装策略展示了在更低浓度下增强细胞凋亡的协同效应。

·细胞表面ALP触发的组装：通过在细胞表面表达ALP，可以触发磷酸化碳水化合物衍生物的组装，展示了在肽纳米纤维之外的广泛适用性。这种方法在不同的细胞类型中均表现出良好的细胞相容性和功能增强。

_{·脑内导电聚合物的原位合成：利用过氧化物酶（HRP）在大脑内进行导电聚合物的原位合成。研究者向斑马鱼脑中注射了HRP和葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶，这些酶将内源性葡萄糖或乳酸氧化，产生的过氧化氢（H2O2）用于HRP催化的导电聚合物聚合。这种聚合物在脑组织内形成导电凝胶，与神经元及其网络紧密集成。通过在斑马鱼脑切片上进行电生理测量，研究者发现这些聚合物可以显著降低金电极和神经之间的阻抗，展示了在神经调控和脑机接口中的应用潜力。}

图4：基因靶向的化学组装. (a) 基于APEX的基因靶向化学组装示意图。 (b-c) 原位基因靶向合成的聚苯胺（PANI）。(d) 光遗传聚合技术：单个神经元分辨率下电功能材料的光学控制基因靶向原位组装。 (e-f)表达miniSOG蛋白并聚合PDAB (e) 或PANI (f)的大鼠皮层神经元的共聚焦和透射光图像。

（3）基于基因靶向的化学组装（图4）

基于前人的工作，我们创新型地提出了基因靶向自组装方法，通过基因工程改造的酶在特定细胞结构中组装功能材料，展现了高分辨率和高特异性，以及具有细胞特异性的优点。这些技术为高精度的生物系统调控提供了新的工具。具体而言，我们实现了

_{·APEX催化聚合：APEX是一种经过基因工程改造的抗坏血酸过氧化物酶，能够在特定细胞结构中催化功能聚合物的组装。我们通过基因工程在特定细胞结构中表达APEX，在存在过氧化氢（H2O2）的情况下，可以在细胞膜上聚合形成功能性聚合物，实现高分辨率的材料组装。例如，在神经元膜上聚合的聚对苯二胺（PDAB）可以降低膜电容，增强神经元的响应灵敏度。}

·光遗传聚合技术：我们课题组与麻省理工学院化学系与博德研究所的王潇教授课题组合作，开发了光遗传聚合技术。我们利用miniSOG蛋白作为光敏化剂，在蓝光照射下产生单线态氧，可以在特定细胞和亚细胞结构中精确地聚合形成导电和绝缘聚合物。这种方法通过光控和基因靶向的双重特异性，实现了对神经元兴奋性的精准调控。通过使用AAV载体将miniSOG基因传递到特定神经元，能够在单个神经元分辨率下进行聚合，改变神经元的电生理特性，并且这种效应可以维持数天而不影响神经元存活。

总结与展望

尽管原位组装技术在功能材料和设备与生物系统整合中展示了巨大的潜力，但其实际应用仍面临许多挑战和未解问题。首先，环境条件的差异是一个显著障碍。生物体内的复杂环境可能不利于某些化学反应的进行，需要开发更为生物兼容的反应条件和催化剂。其次，长时间稳定性的问题也是一个重要考虑因素。功能材料在生物系统中的稳定性直接关系到其长期应用的可行性，需要深入研究材料在体内环境中的降解、代谢和潜在的毒性作用。

另外，材料的生物兼容性问题依然突出。尽管许多功能材料在细胞和小型动物模型中表现出良好的生物兼容性，但在更复杂的生物系统中，其潜在的免疫反应和副作用需要进一步评估。尤其是在临床应用中，确保材料的安全性和有效性是至关重要的。

图5：功能材料和器件原位合成的未来：观点、机会和展望. (a-e) 材料和基因工程优化案例。 (a) 附有功能化生物素基团的侧链工程用于聚合物可视化。 (b) 生物素-DAB的化学结构。(c) 亚细胞分辨率下的光遗传图案化聚合物可视化。黄色：mCherry。红色：生物素-PDAB。 (d-e) 通过基因工程实现的APEX2在细胞类型和亚细胞结构特异性组装DAB。 (f-i) 使用功能化黑色素生物合成的磁响应高分子。 (f) 使用酪氨酸衍生物原位合成细胞内磁性黑色素。 (g) 磁性酪氨酸衍生物的化学结构。 (h) 黑色素瘤细胞的磁性控制。 (i) 应用磁场影响黑色素瘤细胞取向性。 (j-m) 可能的导电蛋白纳米线OmcS和PilA结构。 (l) Geobacter sulfurreducens产生的导电纳米线器件以及其在光照和黑暗条件下的典型I-V曲线 （m）。（n-q）可控细胞内光聚合用于癌症治疗。(n) 光聚合机制示意图。 (o-p) 接受或未接受光聚合治疗的T1肿瘤负荷BALB/c小鼠的肿瘤负荷(o) 和生存曲线 (p)

未来的研究应集中于以下几个方面 （图5）：

1.扩大材料选择范围：目前，原位组装技术主要应用于有限的几种材料，如聚对苯二胺（PDAB）和聚苯胺（PANI）。未来应探索更多种类的功能材料，并通过化学修饰和基因工程技术，赋予这些材料新的功能和特性。

2.开发新的基因和材料设计策略：通过基因工程技术，结合光学控制元素，可以实现对材料组装的更精确控制。例如，利用不同光谱区域的遗传编码光敏化剂，可以实现多色调控不同细胞类型和亚细胞结构的材料组装。

3.在体应用研究：尽管目前大多数原位组装技术的应用集中于体外系统，如培养细胞，但在活体中的应用研究应进一步加强。尤其是在疾病治疗和组织功能增强方面，探索这些技术在体内的应用潜力，如利用原位组装技术进行精准的癌症治疗和神经系统疾病的调控。

4.探索新型生物合成材料：例如，利用细菌导电蛋白纳米线作为电子元件，或者开发响应磁场的生物合成材料，这些新材料的探索和应用将为原位组装技术的进一步发展提供新的方向。

总之，随着原位组装技术在材料科学和生物学交叉领域的不断发展，我们有理由相信，这些技术将为理解和调控生物系统提供新的工具，促进生物医学研究和临床应用的进步。未来的研究将进一步推动这项技术的应用，帮助我们更深入地探索生命的奥秘，并开发出新的治疗和增强方法。

参考文献

(1) Liu, J., et al. (2020). "Genetically Targeted Chemical Assembly of Functional Materials in Living Cells, Tissues, and Animals." Science.

(2) Sessler, C. D., et al. (2022). "Optogenetic Polymerization and Assembly of Electrically Functional Polymers for Modulation of Single-Neuron Excitability." Science Advances.

课题组介绍

哈佛大学刘嘉课题组的目标是在多个尺度上将电子学与生物学结合。课题组汇集了来自生物工程、电子工程、化学、生物信息学、计算机科学、材料科学和机械工程等领域的专家，利用纳米电子学、柔性材料和基因工程，并结合与半导体工业兼容的光刻技术，开发出可扩展的生物电子学平台。我们致力于将这些可扩展的生物电子技术与半机械人工程、人工智能、单细胞基因组学、成像和计算分析相结合，实现电子学与生物学的无缝结合，融合机器智能与自然智能。通过这一平台，课题组开发出能够跟踪和控制活体有机体和行为动物中单个细胞多模态活动的工具，这些活动具有细胞类型特异性，并能在时间和空间上对大量细胞进行统计和稳定追踪。利用专业的实验和计算知识，我们旨在理解单细胞多模态生理和基因表达的群体动态与整个器官和生物体功能和功能障碍之间的关系。同时，我们致力于将人工智能技术与脑机接口相结合，开发整合先进AI算法、高通量柔性脑机接口的通用平台，进一步在单神经元分辨率下解码神经活动与行为、意识以及疾病之间的复杂联系, 从而为科学研究和临床应用提供强有力的支持。

我们的研究领域涵盖脑机接口、神经工程、基因组学、干细胞工程、心脏和胰腺疾病以及发育障碍等方面。2022年，刘嘉教授入选《麻省理工科技评论》全球“35岁以下科技创新35人”榜单。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.accounts.4c00049