第一作者：谢玄

通讯作者：聂舟、黄燕、王洪辉

通讯单位：湖南大学

论文DOI：10.1002/anie.202410380

全文速览

该论文着重归纳总结了聂舟教授团队开发了一种名为GRAS（Gas signaling molecule-Responsive Artificial
DNAzyme-based Switches）的新型人工DNAzyme分子开关，它能够响应气体信号分子，如硫化氢（H₂S），并用于精确调控细胞功能。

背景介绍

气体信号分子在生物医学研究中越来越重要，因为它们能够通过改变物理状态或将生化输入转换为多种生物输出来适应各种生物信号。硫化氢（H₂S）、一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）等气体信号分子是能够穿透细胞膜并在多种生物功能中发挥关键作用的小气体分子。它们通常通过激活特定酶，如鸟苷酸环化酶和硫氧还蛋白氧化还原酶，来调节细胞功能。因此，开发适当且可编程的化学工具以响应气体信号分子是非常可取的。

通过体外筛选鉴定的DNAzyme是一种具有酶样特性的催化DNA分子，它们能够催化特定的化学反应，如DNA或RNA的水解。由于它们易于修改和工程设计，因此越来越被认为是创造响应性分子开关的备选材料。为了赋予DNAzyme刺激响应刑特征，采用了各种化学修饰策略改造核苷酸的特定位点（如2'-OH、硫代磷酸挂骨架（PS）主链或核苷酸碱基）来调节DNAzyme的切割活性。然而，将化学工程原理应用于开发对气体信号分子有反应的DNAzyme在很大程度上尚未探索。

为此，他们采用了叠氮化修饰改造DNAzyme来构建GRAS，能够精确地在亚细胞水平上对实现对细胞功能的调控。例如，通过DNAzyme介导的RNA切割，有针对性地抑制细胞质中的特定mRNA，从而调控与这些靶基因相关的细胞功能，如诱导肿瘤细胞凋亡。此外，GRAS可以与DNAzyme触发的细胞表面受体上的动态DNA组装集成。基于GRAS的DNA纳米器件将H₂S信号输入转换为启动信号，以激活动态链置换反应，进而触发受体酪氨酸激酶（RTKs）信号，控制细胞增殖和迁移等基本细胞行为。GRAS为创造对气体信号有反应的化学-生物电路提供了创新的工具包，为先进的靶向细胞工程开辟了新的途径（图1）。

图1.H₂S响应性GRAS调节细胞功能示意图。

图2. 设计构建GRAS的示意图，以及在亚细胞层面对细胞功能的精准调控。

研究内容

首先，为了探索PS骨架位点特异性修饰的DNAzymes以实现对气体信号分子的响应性激活。他们选择了对钠离子驱动的NaA43T DNAzyme进行修饰改造，通过在催化核心区域的关键位点引入叠氮修饰，可以设计出能够响应H₂S的DNAzyme开关（GRAS）。并通过位点特异性修饰来构建不同的分子开关，并考察其性能差异。例如，NaA43T-3Az
(G₄G₁₁G₁₅) 的开关比约为10.21，高于NaA43T-3Az (G₂₂G₂₃T₂₄) 的8.4，表明位点修饰与DNAzyme开关的性能密切相关。此外，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和荧光恢复实验，证实了NaA43T-3Az通过H₂S激活以启动开关的能力（图3）。因此他们成功构建了了H₂S激活的GRAS。

图3. 构建气体信号分子响应型DNAzyme开关。(A) H₂S介导的脱保护反应机理。(B) NaA43T DNAzyme的示意图，“*”表示叠氮基团的修饰位点。(C) NaA43T DNAzyme催化核心区的特定位点修饰以及修饰这些位点对DNAzyme活性的影响。(D)比较不同分子开关的阻断效率以及H₂S还原活化处理后的开关比率。(E)凝胶电泳分析。(F-G)荧光恢复分析底物裂解的浓度和时间依赖性。

接着，他们将结构引导的合成后修饰策略扩展到其他DNAzyme，以进一步证明其多功能性。10-23 DNAzyme是一种RNA裂解DNAzyme，能特异性识别并裂解目标RNA序列，已被应用于基因调控、检测特定RNA分子的分子诊断和治疗领域。实验结果表明，在靠近5' 端附近连续修饰C₃T₄A₅（10-23-3Az）可将活性降低至~5%。叠氮化物自褪色修饰的限制效应可能是由于立体修饰改变了催化核心区的构象，影响了其与辅助因子的相互作用。当H₂S发生还原活化时，会引发叠氮基团的脱保护，从而恢复DNAzyyme与辅助因子的识别，并快速恢复DNAzyme的活性。

图4. GRAS工程策略对其他DNAzyme改造的可行性分析。

在体外证明了 GRAS 在响应气体信号分子时高效裂解底物的有效性之后，他们进一步想要探索GRAS在亚细胞调控方面的潜在应用。初步研究重点是将GRAS平台用于细胞内mRNA的定向裂解，从而促进对特定细胞过程的精确调控。以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为研究对象，他们成功证实了GRAS-EGFP在响应H₂S激活后可以降解细胞内EGFP mRNA的含量，并下调EGFP的表达（图5）。同时，他们还证实了，当暴露于细胞内的H₂S时，GRAS可以有效下调癌细胞中致病蛋白的表达，从而抑制肿瘤细胞的活性。

图5. 气体信号分子H₂S激活基因沉默型GRAS诱导细胞死亡。

此外，鉴于Na⁺作为细胞外环境中最丰富的金属离子之一，为NaA43T DNAzyme的正常运转提供了有利环境。他们考虑将DNAzyme介导的切割活性与链置换反应相结合，实现基于GRAS的动态DNA组装。这使得设计出对H₂S有响应的人工地受体成为可能，并调节细胞信号传导。以肝细胞生长因子受体（c-Met）作为模型受体，他们开发了一种基于GRAS的DNA组装系统（Met-GRAS），用于精确控制受体介导的细胞过程，以响应H₂S信号分子。c-Met作为一种典型的受体酪氨酸激酶，可以通过肝细胞生长因子激活，通过二聚体诱导的自磷酸化，诱导受体介导的信号传导途径和细胞行为（图6）。

图6.构建H₂S信号分子响应型受体信号转导系统，并激活L929细胞增值迁移。

总结与展望

在本研究中，通过在DNAzyme的催化核心区域引入氧化还原响应的叠氮基团，创建了对硫化氢气体信号分子（H₂S）敏感的分子开关。这些开关利用气体信号分子的跨膜特性，在不同亚细胞区域激活，精确控制细胞功能。GRAS系统的激活能够选择性地降低癌细胞中的mRNA表达，抑制细胞增殖并促进凋亡。此外，结合了DNA介导的链置换反应，开发了一种对H₂S有反应的DNA纳米器件，能够调控细胞表面受体功能。在未来，基于DNAzyme的分子开关面临的挑战包括设计可预测控制的气体信号分子激活，定义健康与疾病状态下的激活阈值，以及确保GRAS系统在复杂生物环境中的长期应用安全性和稳定性。此外，还包括开发具有剂量和时间依赖性响应的智能GRAS系统，引入适当的化学修饰来提高生物相容性，以及扩展人工DNAzyme开关对更多刺激的响应能力，以增强其在生物医学中的应用范围。

课题组介绍

湖南大学化学与化工学院聂舟教授，博士生导师

长期从事生命分析化学基础研究，紧密围绕生物医学中关键机制研究的需求，系统性开展生物分子工具创建及其生命分析应用基础研究。近年以通讯作者在 Nat. Chem. Biol., J. Am. Chem. Soc.(2), Angew. Chem. Int. Ed.(10)，Science Advances, Nano Lett.(2)等高水平期刊发表学术论文100多篇，出版个人专著2章，授权国家发明专利7项，主持国家自然科学基金杰青、重点、优青项目及国家重点研发计划课题等项目。担任中国化学会理事、青年化学工作者委员会副主任委员、英国皇家化学会《RSC Advances》副主编（2015-2022）、《分析化学》编委，入选长江学者青年学者、万人计划青年拔尖人才等高层次人才计划，获药明康德生命化学研究奖学者奖、中国化学会青年化学奖、卢嘉锡优秀导师奖、湖南省优秀科技工作者、湖南省优秀研究生导师等奖励荣誉，作为主要成员获得湖南省科学技术创新团队奖、湖南省高等教育教学成果一等奖。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202410380