第一作者：柴玉、余灿、陈芝

通讯作者：万阳副教授、李翔副教授

通讯单位：江西中医药大学、海军军医大学

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c04329

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刺激响应性且完全可逆的化学修饰方法对多肽递送系统和化学生物学的发展至关重要，在本研究中，我们介绍了一种简单有效的基于甲硫氨酸（Met）的可逆化学策略，通过在弱酸性条件下选择性烷基化含Met的肽，形成稳定的C–S⁺键，此键可在刺激下通过1,6-消除反应快速断裂。该策略在多种应用中得到了验证：（i）毒性降低和酶稳定性增强的抗菌肽的聚乙二醇化前药；（ii）具有提高细胞膜通透性和疗效的酯酶响应多肽-多肽偶联药物（PPICs）；（iii）靶向细胞内、细胞外位点的构象可控型可逆环肽；（iv）生物正交控制的C-末端Met-笼蔽神经肽。

背景介绍

多肽和蛋白质是重要的治疗药物和生物学工具，为了实现它们在复杂生物环境中的可控释放与功能调控，发展刺激响应性且完全可逆的偶联化学显得尤为关键。当前，可逆修饰多肽的反应位点主要集中于赖氨酸和半胱氨酸。赖氨酸在蛋白质中含量较高（~5.9%），往往导致修饰位点选择性差；而半胱氨酸则常以二硫键形式存在，且目前修饰策略多数依赖胞内高浓度硫醇环境触发脱除，限制了其广泛应用（图1a）。相比之下，甲硫氨酸（Met）含量相对较低（~2.4%），具备潜在的位点特异性修饰优势。目前，虽然已有少量关于甲硫氨酸可逆修饰的研究报道，但普遍缺乏模块化且适配多种应用场景的断键策略（图1b）。因此，构建一种兼具精准修饰能力、生物功能调控性，以及适用于多种应用场景的可逆化学平台，仍是该领域亟待突破的关键科学问题。

研究出发点

前期相关研究表明，甲硫氨酸侧链在弱酸性条件下（pH <3）可被选择性烷基化生成锍盐结构。该锍盐可在诸如2-巯基吡啶等强亲核试剂作用下被还原，重建硫醚结构，表明甲硫氨酸侧链具备良好的可逆修饰潜力。对此，万阳课题组创新性地提出通过1,6-苄基消除反应促进C–S⁺键断裂的策略。该反应不仅结构简洁、断键效率高，还具有良好的生物相容性与模块化设计优势。得益于1,6-消除反应对多种分子扳机高度兼容的特性，该断键策略被广泛应用于构建聚乙二醇化（PEG）多肽前药、多肽-多肽偶联药物（PPICs）、可逆环肽体系以及神经肽功能调控等(图1c)。

图1. 现有代表性可逆修饰策略与本研究工作

图文解析

为了验证1,6-消除反应是否能够有效诱导C–S⁺键断裂，研究团队首先设计并合成了一系列含有不同分子扳机的甲硫氨酸锍盐模型化合物（图2a）。其中，化合物 Met-1 在对位引入了一个叠氮基团，可通过Staudinger反应被还原为氨基，进而启动1,6-消除断裂过程。作者对该反应过程进行了系统分析，结果表明：在三羟丙基膦（THPP）条件下，Met-1 可在短短5分钟内被完全还原为甲硫氨酸（Met）。该反应的二级速率常数高达 26.68 M⁻¹·s⁻¹，显示出出色的反应效率（图2b），由此明确证实了1,6-苄基消除可高效驱动C–S⁺键的断裂。不仅如此，研究人员还在其他带有不同分子扳机的锍盐模型中观察到了类似的断裂行为，进一步验证了这一策略的普适性。通过DFT理论计算模拟反应过程，也从能量变化路径上印证了该断键策略的可行性（图2c）。

图2. 1,6-苄基消除诱导C-S⁺断键研究

在成功验证1,6-消除反应可高效诱导C–S⁺键断裂的基础上，作者进一步设计并合成了一个具备 Staudinger 触发响应能力、且便于后续功能扩展的模块化连接子6。研究表明，该连接子不仅能够在弱酸性条件下实现对含甲硫氨酸多肽的高效、选择性修饰，更可在加入THPP 后，通过 Staudinger 反应快速且定量地“去修饰”，释放母肽。基于此，作者进一步围绕该连接子开展了一系列功能化应用研究。下面，我们将对其中两个具有代表性的应用案例进行简要介绍：聚乙二醇化抗菌肽前药和神经肽功能调控。

抗菌肽被誉为下一代极具潜力的抗菌药物，但其临床应用却受到溶血毒性高、代谢稳定性差等因素的严重制约。为了解决这一难题，研究人员尝试通过可逆性PEG修饰来提升其药物性能。这种策略不仅能够有效降低抗菌肽的溶血毒性并提升其代谢稳定性，同时又能避免传统稳态PEG化所导致的抗菌活性下降问题。作为概念验证，作者选用了天然抗菌肽Macropin为模型，通过“两步法”修饰策略，成功构建了其PEG化前药——Mac-6-mPEG₂₀₀₀（图3a）。实验结果显示，相较于未修饰的母肽Macropin，Mac-6-mPEG₂₀₀₀表现出更佳的生物相容性与显著增强的代谢稳定性。值得一提的是，尽管该前药本身在体外几乎不具备抗菌活性，但在THPP的触发下，能够迅速且高效释放Macropin，从而恢复其原有的抗菌能力（图3d,e），展示出极高的治疗可控性与应用前景。

图3. 聚乙二醇化抗菌肽前药研究

神经肽作为一类重要的神经递质，近年来受到广泛关注，但令人遗憾的是，大多数神经肽具体的作用机制仍不清晰。为了更好地研究神经肽的生物功能，科研人员常常采用“笼化”策略，即通过化学方式暂时封闭其活性，在光照或特定小分子刺激下再“解笼”恢复活性。然而，由于神经肽构效关系普遍复杂，现有的“笼化”方法常常缺乏靶向性和精准性，在实际应用中存在较大挑战。越来越多的研究显示，许多神经肽的C端疏水区对其生物功能至关重要，但这一区域因结构稳定、反应位点少，传统修饰手段难以实现精准控制。在深入分析神经肽序列后，作者发现一个有趣的现象——大量神经肽的C端都含有一个甲硫氨酸（图4a），为实现精准修饰提供了独特切入点。基于此，作者创新性地提出 “神经肽C端Met笼化”策略（图4b）。以神经肽P物质（Substance P, SP）为例，作者设计了一个遮蔽肽RG₁₂，与SP通过连接子6实现共价偶联，成功构建了笼化神经肽SP-6-RG₁₂。实验表明，与原始SP（EC50 = 3.4 nM）相比，SP-6-RG₁₂对受体的亲和力下降了约5500倍（EC50 = 18.3 μM），功能几乎完全封闭。更重要的是，在THPP的作用下，SP-6-RG₁₂可高效释放母肽SP，迅速恢复其生物活性（图4d）。该结果不仅验证了C端Met“笼化”策略的高度可控性与高效性，也为神经肽功能研究与调控提供了一个全新思路。

图4. 神经肽功能调控研究

总结与展望

综上所述，本文创新性地提出了一种基于1,6-消除反应诱导C–S⁺键高效断裂的策略，并将其广泛应用于生物活性多肽的靶向递送与功能调控。该研究不仅在多肽药物开发中展现出良好前景，也为化学生物学领域提供了全新的可逆修饰工具。

课题组介绍

万阳副教授课题组主页：https://www.x-mol.com/groups/wan_yang

原文信息

Yu Chai, Can Yu, Zhi Chen, Wenbin Duan, Huanwen Chen, Xunxiang Qiu, Zhengyang Xu, Shengzhang Liu, Anastasia Danilenko, Gilles Frison, Valérie Alezra, Emeric Miclet, Xiang Li,* and Yang Wan* J. Am. Chem. Soc. 2025. DOI: 10.1021/jacs.5c04329