第一作者：A. Katherine Hatstat

通讯作者：William F. DeGrado教授，张少庆研究员，A. Katherine Hatstat博士

通讯单位：

•加州大学旧金山分校药学化学系及心血管研究所 (A. K. Hatstat, W. F. DeGrado)

•中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 (S.-Q. Zhang)

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c02273

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在蛋白质设计领域，从头构建能够响应刺激并进行变构信号传递的分子系统是一项重大挑战。天然存在的细菌组氨酸激酶 (HKs) 能够将配体结合等信号跨膜远距离传递并放大。本研究成功从头设计了一种新型Zn²⁺结合传感器结构域，并将其替换到天然跨膜组氨酸激酶的对应部分，构建了能够有效传递信号的人工嵌合激酶。研究表明，信号转导的成功与否不仅取决于设计的传感器结构域的稳定性，还与连接传感器和下游结构域的连接子（linker）的长度和相位密切相关。通过对传感器结构域进行精细的稳定性调控（降低其预组织程度），研究团队显著增强了嵌合激酶对Zn²⁺的响应动态范围，并展示了其对特定金属离子的传感能力。这项工作为理解和设计新型的人工细胞信号系统提供了重要的理论指导和实验依据。

背景介绍

在蛋白质设计领域，要凭空创造出能够响应外界刺激并进行变构信号传递的分子系统，无疑是一项重大挑战。跨膜信号传递是生物体感知外界刺激并触发细胞内反应的核心过程。在细菌中，组氨酸激酶（HK）作为双组分系统的关键组成部分，通过胞外结构域感知信号（如金属离子、代谢物等），并将构象变化传递至胞内催化结构域，最终通过磷酸化级联反应调控基因表达。然而，天然HK的信号特异性受限于其进化形成的传感器结构域，如何通过工程化手段重新设计传感器以实现用户定义的信号响应，一直是合成生物学和蛋白质工程领域的重大挑战。

尽管近年来蛋白质从头设计技术取得了显著进展（如设计离子通道、配体诱导的构象开关等），但在跨膜系统中实现多结构域协同信号传递仍面临两大难题：其一，传感器与跨膜结构域的热力学耦合。信号传递要求传感器结构域的构象变化能有效改变下游结构域的自由能（ΔG），但人工设计的传感器常因过度稳定或构象灵活性不足导致信号传导效率低下。其二，连接子（Linker）的优化。连接传感器与跨膜螺旋的连接子长度和相位（α螺旋周期性）直接影响信号传递的方向性和效率，但其设计规则尚不明确。本研究旨在探索我们当前的知识是否足以从头设计一个配体结合结构域，并使其能够高效地将结合信号跨越生物膜传递超过100 Å的距离，最终激活胞内的激酶活性。

研究亮点

1.创新性从头设计Zn²⁺传感器并实现功能性跨膜信号转导

^{研究团队基于张少庆和DeGrado先前设计的能结合Zn2+的四螺旋束蛋白} 4EH2，通过引入螺旋间环区，成功设计了一个全新的、二聚体的Zn²⁺传感结构域 (Zn-sensor^long) 。该结构域能够特异性结合Zn²⁺，并首次被证明可以替代天然HK中的传感器域，在嵌合蛋白中介导由Zn²⁺触发的跨膜信号传递。

2.系统揭示连接子长度和传感器稳定性对信号传递的关键调控作用

研究发现，连接新设计传感器与HK跨膜结构域的连接子长度和相位，对信号输出有显著影响，特别是Link₂的长度呈现出与α-螺旋周期性相关的调控模式 。更重要的是，通过理性地降低传感器结构域的预组织程度（即“去稳定化”），显著提高了系统对Zn²⁺的响应灵敏度和动态范围，验证了信号转导的热力学模型。

3.构建具有金属离子选择性的人工激酶，为设计定制化细胞传感器提供新策略

优化后的嵌合激酶不仅对Zn²⁺表现出毫摩尔级别的表观响应浓度（尽管体外传感器结合亲和力为纳摩尔级别，这反映了信号传递中的能量消耗），还展现了对Zn²⁺相对于其他二价阳离子（如Ni²⁺, Co²⁺）的更强激活效果，对Mn²⁺则无明显响应 。这表明该系统具备一定的金属离子识别特异性，为未来按需设计能感知特定小分子或离子的细胞内传感器件奠定了基础 。

图文解析

1.新型Zn²⁺传感结构域 (Zn-sensor^long) 的设计与体外表征

研究团队以张少庆和DeGrado先前设计的能结合Zn²⁺的四螺旋束蛋白4EH2为蓝本。4EH2在结合Zn²⁺后其四螺旋束构象会更加稳定。为了将其改造为适合整合进HK二聚体骨架的传感器，研究人员通过计算设计引入了连接相邻螺旋的柔性环区，构建了一个由两个螺旋-转角-螺旋发夹结构组成的C2对称二聚体传感结构域，命名为Zn-sensor^long。该设计旨在模拟天然HK传感器中保守的、位于同源二聚体界面的周质螺旋结构。为了在体外准确评估其Zn²⁺结合特性，Zn-sensor^long与一个GCN4亮氨酸拉链结构域融合表达纯化，以确保其形成稳定的二聚体。等温滴定热量法 (ITC) 实验表明，该GCN4-Zn-sensor^long融合蛋白能够以纳摩尔级别的高亲和力结合Zn²⁺。

图1. 细菌的组氨酸激酶介导跨膜信号转导

2.嵌合组氨酸激酶的构建、筛选与初步信号响应

随后，研究人员将从头设计的Zn-sensor^long结构域替换大肠杆菌CpxA (一种组氨酸激酶) 的天然传感结构域，构建了一系列嵌合蛋白。成功的信号转导不仅取决于传感结构域本身，还严重依赖于连接传感结构域和下游跨膜 (TM) 结构域的连接子 (linker) 的特性。因此，研究团队系统地改变了连接Zn-sensor^long与CpxA跨膜螺旋的N端连接子 (Link₁) 和C端连接子 (Link₂) 的长度 (各1-7个氨基酸)，构建了一个包含49个样本的嵌合体文库。利用基于荧光报告基因 (mCherry) 的大肠杆菌细胞筛选方法，评估了不同嵌合体的信号转导活性。结果显示，Link₂的长度对嵌合激酶的基础信号活性呈现出周期性影响，其变化频率与α-螺旋的重复周期 (约3.6个残基/圈) 相符。然而，这些基于Zn-sensor^long的初始嵌合体对Zn²⁺的响应普遍较弱，即加入Zn²⁺后荧光信号的变化不显著。

图2. 对具有完全从头设计传感器结构域的HK进行重新工程化的理由及嵌合体变体筛选

3.通过降低传感器稳定性增强信号动态范围

研究人员推测，Zn-sensor^long响应弱的原因可能是其结构在未结合Zn²⁺时也已过于稳定和预组织，导致Zn²⁺结合所诱导的构象或能量变化不足以有效地传递给下游结构域。根据热力学信号传递模型，一个预组织程度较低（即不太稳定）的传感器在结合配体时会经历更大的自由能变化，这可能转化为更强的信号输出动态范围。基于此假设，他们通过截短Zn-sensor^long中的螺旋，减少了核心疏水堆积，设计了两种稳定性降低的变体：Zn-sensor^top (在Zn²⁺结合位点上方，远离跨膜区的一端截短) 和Zn-sensor^bottom (在Zn²⁺结合位点下方，靠近跨膜区的一端截短)。对这两个新传感器变体构建的嵌合体文库进行筛选后发现，特别是Zn-sensor^bottom系列的多个嵌合体，在加入Zn²⁺后表现出显著增强的mCherry荧光信号，且整个细胞群体的响应更为均一，而非像Zn-sensor^long那样仅有部分细胞响应。这表明降低传感器的预组织程度确实能够有效提升信号传递的动态范围。

图3. 新生成的传感器结构域域的失稳增加了信号传导的动态范围

4.最优嵌合体的金属离子响应特异性

为了进一步表征优化后传感器的性能，研究团队选择了Zn-sensor^bottom文库中响应最灵敏的嵌合体 (Link14−Link25)，测试了其对不同二价金属离子的响应特异性。通过在细胞培养基中加入浓度梯度的Zn²⁺、Ni²⁺、Co²⁺和Mn²⁺进行测试，结果显示，该嵌合激酶对Zn²⁺表现出最强的激活效果和最大的信号动态范围。相比之下，Ni²⁺和Co²⁺也能引起一定的激活，但程度弱于Zn²⁺；而Mn²⁺在测试浓度范围内几乎不产生激活信号。值得注意的是，在细胞体系中观察到的激活中点浓度 (EC50) 远高于传感器在体外与Zn²⁺结合的纳摩尔级亲和力。这种表观亲和力的降低在天然HKs信号系统中也普遍存在，反映了配体结合能一部分被用于驱动传感器及下游结构域发生构象变化，从而完成信号跨膜传递的能量消耗。这些结果表明，设计的传感器系统不仅对Zn²⁺有响应，还具备一定的金属离子选择性。

图4. 最优嵌合体对不同二价金属离子的剂量响应曲线及选择性

总结与展望

本研究首次将热力学耦合模型应用于从头设计的跨膜系统，证实了能量传递的层级性——传感器结构域的构象变化需通过连接子传递至跨膜螺旋，并逐级影响胞内催化结构域的磷酸化活性。还揭示了“预组织化”陷阱的规避：过度稳定的传感器（如Zn-sensor^long）因构象刚性导致ΔG变化不足，而适度截短（如Zn-sensor^bottom）通过降低预组织化程度，释放了构象变化的自由度。

这些发现为未来设计具有全新、可定制感知能力的细胞通讯和传感系统提供了重要的指导原则和实验框架。未来的研究可以进一步探索连接子序列的优化、传感器稳定性和结合位点几何形状的精细调控，以及对报告基因启动子进行工程化改造，以期获得动态范围更广、特异性更高的人工信号系统。随着蛋白质设计和合成生物学技术的飞速发展，有望创造出更多服务于生物医学研究和生物技术应用的智能分子器件。

课题组介绍

W. F. DeGrado教授：https://pharm.ucsf.edu/degrado

张少庆研究员：https://zhanglab.sibcb.ac.cn/zhanglab/

招聘信息

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原文信息

Hatstat, A. K., Kormos, R., Xu, V., Du, G., Liu, L., Zhang, S.-Q., & DeGrado, W. F. (2025). A Designed Zn²⁺ Sensor Domain Transmits Binding Information to Transmembrane Histidine Kinases. Journal of the American Chemical Society.

DOI: 10.1021/jacs.5c02273